环境微生物实验讲义

《环境微生物实验讲义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、东南大学环境工程系环境微生物实验03213720李翩2015/6/2317/17实验四微生物的染色一、目的学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。二、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚，通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成的，所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和

2、酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基成碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点在pH=2—5之间。故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH>7）或偏酸性（pH=6—7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红等。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。三、染色方法有简单染色法和复杂染色法之分1.简单染色法简单染色法又叫普通染色法，只

3、用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色法即可。2.复杂染色法用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复杂染色法有革兰氏染色发和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。此处介绍革兰氏染色法。革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两大类。它的染色步骤如下：先用草酸铵结晶紫染色，经碘—碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，呈紫色者叫革兰氏

4、阳性菌。被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。四、仪器和材料1.显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯（或煤气灯）2.石碳酸复红（或美蓝）染液、草酸铵结晶紫染液、革式碘液、95%乙醇，蕃红染液3.枯草杆菌、大肠杆菌五、实验内容和步骤（一）细菌的简单染色步骤1.涂片取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接17/17种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种（大肠杆菌或枯草杆菌）与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜

5、过大。（注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可。）2.干燥最好早空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。3.固定将易已燥的涂片正面朝上，在微笑的火焰上通过2—3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。4.染色在载玻片上滴加染色液（石碳酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种），使染液铺盖涂有细菌的部位作用约1分钟。5.水洗倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水成无色为止。6.吸干将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠（注意

6、勿将细菌擦掉）。7.镜检用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。（二）细菌的革兰氏染色步骤1.取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。方法均与简单染色法的相同。2．用草酸铵结晶紫染波染1分钟，水洗。3．加革氏碘液媒染1分钟，水洗。4.斜置载玻片于一烧厘米杯之上，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30秒至45秒，水洗。）5．用蕃红染液复染1分钟，水洗。6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的

7、颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。染色关键：必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌，若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。六、实验结果与讨论大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。视野左上方有大量红色的、短小的杆状细菌，但不是单个存在，推测为大肠杆菌。右上方为紫色的、杆状的细菌，推测为枯草杆菌，由于放大倍数有限，看不见芽孢。17/17

8、七、思考题1．微生物的染色原理是什么？被染物与染色剂结合或反应，比如细胞壁与染色剂结合或反应。2．你用革兰氏染色法染大肠杆菌和枯草杆菌后各得什么结果（包括颜色、细菌形态、为何种染色反应等）？大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏