微生物实验技术讲义

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1、开课编号：513041Y微生物学实验技术ExperimentofMicrobiology课程编号：S071005ZY009课程属性：专业课学时/学分：60/1预修课程:微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学教学目的和要求：本课程为微生物学专业研究生专业课，也可作为相关专业研究生的选修课。通过本课程的教学，训练学生掌握微生物学的操作技能；进一步了解、深化微生物学的基本理论，加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识，同时通过实验，培养同学观察、思考、分析问题和辩证思维能力，为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。实验一微生物实验综合介绍（8h）（刘利新）微生物学实验室安全操

2、作规程讲解本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002），该《准则》于2003年8月1日实施。规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级及其基本要求。本节课将对其中内容进行选择性讲解，期望对新入实验室的学生规范化管理起到积极的促进作用。微生物实验设备综合介绍3.细菌、放线菌分离培养基的制备为保证下节实验课的顺利进行，本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。详细步骤参见实验二中培养基制备。实验二从自然界分离筛选微生物菌种（8h）（戴欣）一、实验目的掌握环境样品微生物分离培养的基本方法，并对分离得到的微生物进行初步分类

3、鉴定二、实验原理自然界中存在着各种各样的微生物，可以通过人工培养基提供微生物生长所需要的营养物质，将其中部分微生物从环境中分离出来。不同的微生物对营养要求有很大的差别，明确这一点非常重要。培养基配制的基本原理是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养物质，一般包括碳源、氮源、无机盐和水。由于微生物无处不在，因此培养基在使用之前必须灭菌。对于大部分培养基而言是可以通过高压湿热灭菌来实现。由于微生物核糖体小亚基RNA基因功能稳定、分布广泛且由高变区和保守区相间组成，是目前广泛应用的微生物分子分类鉴定标准。本实验通过对微生物的16SrRNA基因序列分析

4、从而对其进行初步分类鉴定。三、实验内容及步骤1.细菌、放线菌分离培养基的制备培养基配制的基本步骤：1）先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水2）称量培养基各组分3）溶化各组分，如需要可搅拌或加热4）调pH,定容5）分装。如需配制固体培养基可加入1.5%琼脂粉6）高压蒸汽灭菌：一般选择1219/20血门，但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择115°C/20minoR2A培养基（细菌用）：酵母提取物:0.5g；蛋白月东:0.25g；酪氨酸:0.75g；葡萄糖:0.5g；淀粉:0.5g；磷酸氢二钾：0.3g；硫酸镁：0.024g；丙酮酸钠：0.3g；加水稀释至1L,调节pH

5、至7.5・7.8,琼脂15g,115°C灭菌20分钟后倒平板；GYM培养基（放线菌用）：酵母提取物：4g；麦芽糖：10g；葡萄糖：4g；碳酸钙：2g；加水稀释至1L,调节pH至7.5・7.8,琼脂15g,115°C灭菌20分钟后倒平板。1.样品的采集和保存采集用具和样品放置容器严格灭菌处理，防止样品污染。微生物分离培养样品短期可49保存，长时间存放最好冷冻保存。2.微生物分离培养微生物的分类培养要特别注意无菌操作，无菌操作基本环节如下：1）接种室或超净台要保持清洁，用前使用紫外灯灭菌2）接种的试管、三角瓶等要做好标记，避免弄混。接种使用的枪尖等要做灭菌处理3）接种前双手要

6、用70%酒精消毒，并避免直接接触样品4）培养箱注意清洁，并经常消毒首先根据对样品中微生物生物量的估算，按梯度稀释样品，一般制备原液、10"〜IO”稀释液；如果样品生物量较低，也可选择浓缩样品或经液体培养基富集培养样品中的微生物；然后取100ul稀释（或浓缩）样品液或富集培养物涂布于分离培养基上，28°C（或样品采集环境温度）倒置培养3〜5天。特定微生物的分离培养：根据微生物的营养需求选择性添加营养元素来富集特定微生物、模拟微生物的特定生境（如人工海水或者高温、低温培养X利用微生物的某些降解活性（如纤维素降解活性）分离特定微生物等1.微生物菌株纯化与保存将长出的菌株挑取在新

7、的培养基上进行划线纯化，一般重复2・3次以上；将纯化后的菌株可转至试管斜面培养后置于49短期保藏，也可经液体培养后添加保护剂（甘油、二甲基亚砚、脱脂奶粉等）置于・20°C或・809长期冻存。2.纯化菌株的（分子）鉴定首先对得到的菌种进行液体培养至对数生长期，离心收集菌体，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌的总DNAo然后使用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，扩増条件：94°C4min,94°C1min,55°C1min,72°C2min,30个循环后72°C10min，至4°C停止。PCR产物经电泳检测和PCR产物纯