微生物实验讲义

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1、实验I•四果洒酵母发酵及菌种保藏选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。2.实验原理果酒发酵.•果浆或果汁屮的葡萄糖和果糖在酵母菌的

2、作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成洒精、二氧化碳和少W:的甘汕、岛级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称力人工发酵，利用天然酵母发酵的称为A然发酵。按照工艺的不同又付分为濟汁混合发酵和濟汁分离发酵两种形式。微生物具有容易变异的特性，因此

3、经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、千燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而没计的。保藏方法大致可分为以下儿种.•1）传代培养保藏法又称斜L&J培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6r冰箱内保存。2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜而培养物和穿刺培养物上

4、而覆盖灭幽的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。3）载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。4）寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。5）冷冻保藏法可分低温冰箱（-20至-30°C,-50至-

5、80°C）、干冰酒精快速冻结（约-70°C）和液氮（-196°C）等保藏法。6）冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-7CTC左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力來稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。1.实验材料和用具样品：新鲜水果及压搾汁。试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂

6、奶粉、10%>HCI、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；器皿：三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、40目及100FI筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、洒精喷灯、滤纸条（0.5X1.2cm）冰箱，低温冰箱（-30°C）,液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W）,磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。2.操作步骤4.1自选酵母发酵性性能的检测试验：用选育菌种发酵果酒4.1.1果洒酿造的工艺流程鲜果一分选

7、->破碎、除梗一果浆一分离取汁一澄清一清汁一发酵一倒桶一贮酒一过滤一冷处理一调配->过滤一成品4.1.2工艺简述1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。①破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的汕酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。破碎机有双辊压破机、鼓形刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片式破碎机等。②二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄淸、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶

8、出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-1OOmg/L。此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结