人脐血间充质干细胞抑制异体t淋巴细胞反应的实验及临床意义论文

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1、人脐血间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验及临床意义论文王茜，杨琨，白海，吴涛，路继红【摘要】目的：研究人脐血间充质干细胞(MSCs)对异体外周血T淋巴细胞抑制的影响.方法：分离、扩增脐血MSCs，流式细胞术检测表面标志以鉴定.取分离培养的脐血MSCs，与经分离的异体淋巴细胞共培养，在植物血凝素（PHA）刺激下.freelanumbilicalcordbloodderivedmesenchymalstemcells(MSCs)onperipheralbloodTlymphocytes.METHODS:MSCsnorma

2、lhumanumbilicalcordblood,culturedinvitro,purifiedandthenidentifiedbyexaminingsurfacemarkerphocytesallogenicperipheralbloodandidentifiedphocytesphocyteproliferationeasuredbyusingMTTreductionmethodandtheeffectofMSCsontheTlymphocytetransformationstimulatedbyPHAanumbil

3、icalcordbloodderivedMSCsinhibitedTlymphocyteproliferationandPHAinducedlymphocytetransformation.ThesecretionofIFNγinsupernatantanumbilicalcordbloodderivedMSCscaninhibittheimmuneresponseofallogenicTlymphocytesandalleviatethegrafeversushostdiseases.【Keyesenchym

4、alstemcells;peripheralbloodTlymphocytes;phytohemagglutinins;interferonTypeⅡ;interleukin4;0引言间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSCs)成为目前倍受关注的一类多能干细胞.人脐血中除含有丰富的造血干细胞，还存在一类不同于造血干细胞的原始细胞，在合适的条件下可以向成骨细胞和脂肪细胞分化，甚至跨系向神经元细胞分化［1］，表现出较强的多向分化潜能.脐血MSCs可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周等组织中分离［2-3

5、］，与骨髓MSCs相比，脐血MSCs具有来源丰富、取材方便、移植排斥反应轻微和外源性污染少等优点，因而具有更大的研究价值和应用潜能.MSCs除具有支持体外造血、促进体内造血重建功能外，还具有抑制同种异体免疫反应，降低移植物抗宿主反应的作用.体内实验表明，器官移植时输注MSCs可减轻排斥反应和延长移植物生存时间.我们试图通过研究人脐血MSCs对异体外周血T淋巴细胞的影响，进一步探讨MSCs的免疫调控机制，为脐血MSCs的应用提供实验依据.1材料和方法1.1材料RPMI1640培养基(华美公司)；淋巴细胞分离液（华美公司）；抗

6、CD13，CD44，CD71，CD166，CD34，CD45，CD3，CD4，CD8荧光抗体（晶美公司）.1.2方法1.2.1脐血MSCs的分离和培养无菌条件取脐带血30mL，肝素抗凝.用PBS平衡盐溶液稀释混匀，Percoll淋巴细胞分离液1500r/min离心20min，吸取界面单个核细胞，LGDMEM培养液，1000r/min离心3min，洗涤2次.显微镜下记数，按1×106/cm2密度分别接种于25T塑料培养瓶，37℃,5mL/LCO2孵箱中培养48h.更换培养液，弃去未贴壁的细胞，每3d半量换液1次.待细胞达到8

7、0%～90%融合，消化、记数.然后进行传代接种培养，记为P1代.再传代培养记为P2代，取P3~P5代进行实验.1.2.2细胞表面分子测定取密度为1×109/L单细胞悬液，与抗CD13,CD44,CD71,CD166,CD34,CD45荧光标记抗体室温反应30min，洗涤、固定，流式细胞仪检测.1.2.3外周血T淋巴细胞分离、鉴定取肝素抗凝新鲜外周血用PBS倍比稀释后，用淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077g/L)分离外周血单个核细胞（PBMC），PBS洗涤2次.计数后以含200mL/LFBS的RPMI1640培养基悬浮

8、，调整细胞密度为8×1010/L，将细胞悬液加入自制尼龙棉柱内，平置于37℃温箱中孵育1h，用预温至37℃的上述培养基冲洗出非黏附细胞即为淋巴细胞.洗下的悬液离心后重悬于上述培养基中并调整细胞密度至1×109/L.取1×109/L个细胞用PBS洗涤2次后与抗CD3,CD4,.freelin