电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析论文

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1、电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析论文【摘要】目的本研究旨在制备骨肉瘤融合细胞瘤苗并检测其体外生物学特性。方法应用电融合技术制备UMR106细胞与大鼠巨噬细胞的融合细胞，经过磁性分选后，流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量和表面抗原的表达。细胞培养检测融合细胞的克隆形成能力，并体外测定其诱导CTL的杀伤活性。结果电融合与磁性分选技术相结合可获得95%的融合细胞纯度。流式细胞仪测定表明，融合细胞可表达较高的MHCⅠ、Ⅱ类抗原。其软琼脂克隆形成能力明显降低（UMR106,29.2±7.2,融合细胞，17.6±5

2、.1,P＜0.05）,而诱导CTL细胞杀伤的能力则显著提高（100∶1时UMR10613.4±3.2，融合细胞42.9±7.5,P＜0.05）。结论骨肉瘤融合细胞可稳定生长，在体内诱导CTL细胞产生较强的抗肿瘤活性.freelacrophagesagiccellsortingunitetry.ThecolonyassayofthecellsandtheanalysisofCTLactivityinducedbyfusioncellsinvivoed.ResultsThehighercellfusionefficie

3、ncycanbeobtainedagiccellssortingunit.ThefusedosteosaracellsexpressedmoreMCHⅠ、Ⅱandformedlesscolonyonsoftarga.ThosecellintensivelyinducedtheCTLactivityagainst.Thecellscanbeusedasvaccineinosteosaratreatmentevaluationonanimalmodels.Keyorvaccine;Cellfusion0引言复发和肺转移

4、是威胁骨肉瘤患者生命的主要矛盾［1］,为此，有必要探讨主动性免疫治疗在骨肉瘤患者中应用的可能性。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的治疗途径值得探讨［2］。本研究应用电融合技术制备骨肉瘤与抗原提呈细胞（主要是巨噬细胞，树突状细胞研究另文报告）的融合细胞，并对其相关的免疫学特性加以研究，为其作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤患者的治疗提供理论指导。1材料和方法1.1实验材料及仪器大鼠骨肉瘤细胞系UMR106购自美国ATCC（AmericanTissueCultureColle

5、ction）;大鼠MHCⅠ、Ⅱ单抗，大鼠巨噬细胞CD68单抗，羊抗小鼠IgGFITC均为英国SEROTEC公司出品；RPMI1640培养基和胎牛血清为Invitrogen公司生产，3HTdR为上海原子能研究所产品。SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心，雄性个体5只，平均体重136克。ECM2001型细胞融合仪购自美国BTX公司；MACS磁分选仪和试剂盒由德国MiltenyiBiotecGmbH生产。1.2细胞培养肿瘤细胞和融合细胞均培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，0.25%胰蛋白酶消化传代

6、。1.3巨噬细胞分离拉颈处死成年SD大鼠，全身70%乙醇灭菌后在超净台中剪开腹腔，用滴管加入10mlRPMI1640不完全培养基灌洗，小心吸出培养基1000r/min,离心5min收集巨噬细胞，培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。1.4细胞融合应用细胞融合仪按1∶5融合巨噬细胞和UMR106细胞。使用3.2mm融合电极，AC为30V10s;DC为640V30μs;2个脉冲。其他操作参见仪器说明书。1.5融合细胞的筛选和分离效果检测应用MACS磁性分选仪和MS+分选柱，按CD68单抗分选试剂盒使用说

7、明操作，分离出CD68+细胞。分选出的细胞做连续传代排除未融合的巨噬细胞，获得相对较纯的融合细胞（MUFs）。将上柱前的细胞、CD68结合细胞和未结合细胞各1×105个，用PBS洗1次并悬浮在80μlPBS中，加入20μlFITC标记的羊抗鼠IgG,孵育10min后PBS洗2次，在400倍荧光显微镜共计数200个细胞（四个视野），根据公式计算回收率和纯度［3］。回收率=100×(N1×P1)/(N0×P0),其中N1为洗脱段的细胞数，P1为洗脱段阳性细胞百分率，N0为上柱前细胞总数，P0为上柱前阳性细胞百分率。1.6

8、DNA含量测定和染色体计数1×105个融合细胞悬浮在200μlPBS中加EB染色10min,流式细胞仪测定细胞DNA含量。培养的融合细胞生长至80%满时加秋水仙碱到终浓度为0.25μg/ml处理3h,胰酶消化后加0.075mol/LKCL低渗处理细胞25min,然后用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定2次，制片后染色拍照。1.7细胞表面抗原的表达1×1