人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定论文

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1、人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定论文郭寿贵，吴平生，王月刚，傅锐斌【关键词】腺病毒Constructionandidentificationofhumanmutanthypoxiainduciblefactor1αadenovirusvector【Abstract】AIM:ToconstructadenovirusvectorcontainingthemutantHIF1αgeneandtostudytheeffectofmutanthypoxiainduciblefactor1αontheangiogenesisofcoronaryheartdisease.M

2、ETHODS:HumanmutantHIF1αcDNAobtainedfromtheplasmidpcDNA3.1(+)HIF1αidpShuttle2.TheexpressioncassettecontainingmutantHIF1αcDNAtherebinantpShuttle2idine2000mediatedgenetransfermethodtopackthevirus.Therebinantadenoviusedbypolymerasechainreaction(PCR)andthetiterined.RESULTS:TherebinantpAdenoHIF1α

3、edbyrestrictionendonucleaseanalysisandDNAsequencinganalysis.ThetransfectedHEK293cellsedthepresenceofrebinantadenovirus.TheviraltiterutantHIF1αgenehasbeensuccessfullyconstructed,utantHIF1αgenetherapyofcoronaryheartdisease.【Keyutant;adenovirusvector;genetherapy【摘要】目的:构建人突变型低氧诱导因子1(HIF1)α腺病毒表达

4、载体，研究人突变型HIF1α基因对冠心病的血管新生作用.方法:采用分子克隆技术，由pcDNA3.1(+)HIF1α（突变型）质粒获得突变型HIF1αcDNA，克隆到穿梭质粒pShuttle2，以PISceI和ICeuI双酶切重组穿梭质粒.freelent，HRE）结合调控血管内皮生长因子（vascularendothelialgroain,ODDD）内564位脯氨酸残基Pro564发生羟基化，迅速被降解.为此我们在已定点突变其Pro564为丙氨酸（Ala）基础上，构建重组人突变型HIF1α腺病毒载体，以进一步研究常氧条件下该突变型基因表达及对冠心病的血管新生作用.1材料和方法

5、1.1材料1.1.1试剂、试剂盒各种限制性内切酶PacⅠ，PISceI，ICeuI等及T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、XGal分别购自Takara，NEB等公司；DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(PAA)，转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)，超纯质粒提取试剂盒（Qiagen）.1.1.2质粒、菌株、细胞系等AdenoXTMAdenoviralExpressionSystems(BD.Clontech):包括有pShuttle2,pShuttle2laZ,AdenoXTMViralDNA等，重组质粒pcDNA3.1（+）HIF1α(突

6、变型)(本室构建)，大肠杆菌DH5α（本室保存），HEK293细胞（中科院上海细胞所）.1.1.3引物HIF1αcDNA片段引物（由博亚公司设计并合成），上游引物：5′GACACAGAAGCAAAGAACCC3′，下游引物：5′TCAAAGCGACAGATAACACG3′，PCR产物片段长460bp.BD.Clontech所提供引物（两个引物分别与穿梭质粒表达盒及骨架质粒的部分序列结合），上游引物：5′TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC3′，下游引物：5′AGATCTGAGCTTTCGCTACC3′，PCR产物片段长287bp.1.2方法1.2.1重组穿梭质粒

7、构建以NheⅠ，ApaⅠ双酶切pcDNA3.1（+）HIF1α（突变型，下同）及pShuttle2，胶回收突变型HIF1α片段及pShuttle2线性化大片段，连接后转化感受态DH5α，于卡那霉素抗性LB平板上筛选单菌落扩增，提取质粒，行酶切及PCR鉴定.1.2.2酶切连接法重组腺病毒骨架质粒以PISceI，ICeuI双酶切pShuttle2HIF1α，胶回收含HIF1α的表达盒片段，与线性化的腺病毒骨架质粒AdenoXTMViralDNA作连接，转化感受态DH5α，氨苄抗性LB平板筛选，挑12~16个