人突变型低氧诱导因子α腺病毒载体的构建及鉴定

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1、人突变型低氧诱导因龛腺病毒载体的构建及作者：郭寿贵，吴平生，王刀刚，傅锐斌【关键词】腺病毒Constructionandidentificationofhumanmutanthypoxiainduciblefactorlaadenovirusvector[Abstract]ATM:ToconstructadenovirusvectorcontainingthemutantHlFlageneandtostudytheeffectofmutanthypoxiainduciblefactor!aontheangiogenesisofcoronaryheartdisease.METHOD

2、S:HumanmutantHlFlacDNAobtainedfromtheplasmidpcDNA3.1(+)HTFlawasclonedintoplasmidpShuttle2・TheexpressioncassettecontainingmutantHlFlacDNAwasobtainedfromtherecombinantpShuttle2withdoubledigestionofPlSceIandICeuIandthenligatedtoAdenoXViralDNAwithinvitroligation.Therecombinantadenoviralplasmidwas

3、identifiedandtransfectedintotheadenoviralpackagingcellHEK293by1ipofectamine2000mediatedgenetrarisfermethodtopackthevirus.Therecombinantadenoviuswasconfirmedbypolymerasechainreaction(PCR)andthetiterwasdetermined.RESULTS:TherecombinantpAdcnoHlFlawascorrectlyconstructedandconfirmedbyrestrictione

4、ndonucleaseanalysisandDNAsequencinganalysis.ThetransfectedHEK293collswerelysedbyfreezethawingtoobtaintherecombinantadenovirusinthelysate.ThePCRproductofthelysateconfirmedtheproseneeofrecombinantTheadenovirus.Theviraltiterwas2X1012pfu/L.CONCLUSION:recombinantadenoviruscontainingthemutantHIFlag

5、enehasbeensuccessfullyconstructed,whichpavesthewayformutantHIFlagenetherapyofcoronaryheartdisease・[Keywords]hypoxiainduciblefactorla;mutant;adenovirusvector;genetherapy【摘耍】目的：构建人突变型低氧诱导因子1011?1）€（腺病毒表达载体，研究人突变型犯？1€（基因对冠心病的血管新牛作用.方法：采用分子克隆技术，_pcDNA3.1（+）HIFla（突变型）质粒获得突变型沿?101cDNA,克隆到穿梭质粒口5比《16

6、2,WPlSce1和1C11双酶切重组穿梭质粒，获得含有突变型HIFla00~八的表达盒，通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒々（1即。乂ViralDNA连接,重组成口々扣1"1?10（腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在册&293细胞中包装成为重组八如「11?10（腺病毒，并进行？08鉴定及滴度测定•结果：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功，包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功，病毒滴度为2X1012pfu/L.结论：成功构建重组腺病毒4016「110"10（（突变型），为冠心病的突变型町？10（基因治疗研究奠定基础.【关键词】低氧诱导因子化;突变；

7、腺病毒；基因治疗0引言低氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1,111?1）是一种在体内广泛存在的由低氧、钻等诱导细胞产生的具有转录活性的核蛋H，由（3和0亚基组成，在低氧应答反应中起关键性作用，它能与靶基因的缺氧反应元件（hypoxiaresponseelement,HRE）结合调控血管内皮生长

8、次I子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）等一系列勒基因的转录，对血管新生等起极其关键的调节作用JlTFla受低氧诱导，决