人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

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1、人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定　　【Abstract】AIM:ToconstructadenovirusvectorcontainingthemutantHIF1αgeneandtostudytheeffectofmutanthypoxiainduciblefactor1αontheangiogenesisofcoronaryheartdisease.METHODS:HumanmutantHIF1αcDNAobtainedfromtheplasmidpcDNA3.1(+)HIF1αidpShuttle2.Theexpres

2、sioncassettecontainingmutantHIF1αcDNAtherebinantpShuttle2idine2000mediatedgenetransfermethodtopackthevirus.Therebinantadenoviusedbypolymerasechainreaction(PCR)andthetiterined.RESULTS:TherebinantpAdenoHIF1αedbyrestrictionendonucleaseanalysisandDNAsequencinganalysis.Thetran

3、sfectedHEK293cellsedthepresenceofrebinantadenovirus.TheviraltiterutantHIF1αgenehasbeensuccessfullyconstructed,utantHIF1αgenetherapyofcoronaryheartdisease.　　【Keyutant;adenovirusvector;genetherapy　　【摘要】目的:构建人突变型低氧诱导因子1(HIF1)α腺病毒表达载体，研究人突变型HIF1α基因对冠心病的血管新生作用.方法:采用分子克隆技术，由pcD

4、NA3.1(+)HIF1α（突变型）质粒获得突变型HIF1αcDNA，克隆到穿梭质粒pShuttle2，以PISceI和ICeuI双酶切重组穿梭质粒，获得含有突变型HIF1αcDNA的表达盒，通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒AdenoXViralDNA连接，重组成pAdenoHIF1α腺病毒质粒，经酶切及测序鉴定正确后，在HEK293细胞中包装成为重组AdenoHIF1α腺病毒，并进行PCR鉴定及滴度测定.结果:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功，包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012p

5、fu/L.结论:成功构建重组腺病毒AdenoHIF1α（突变型），为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.　　【关键词】低氧诱导因子1α;突变;腺病毒;基因治疗　　0引言　　低氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)是一种在体内广泛存在的由低氧、钴等诱导细胞产生的具有转录活性的核蛋白，由α和β亚基组成，在低氧应答反应中起关键性作用，它能与靶基因的缺氧反应元件（hypoxiaresponseelement，HRE）结合调控血管内皮生长因子（vascularendothelialgroain,ODDD）

6、内564位脯氨酸残基Pro564发生羟基化，迅速被降解.为此我们在已定点突变其Pro564为丙氨酸（Ala）基础上，构建重组人突变型HIF1α腺病毒载体，以进一步研究常氧条件下该突变型基因表达及对冠心病的血管新生作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1试剂、试剂盒各种限制性内切酶PacⅠ，PISceI，ICeuI等及T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、XGal分别购自Takara，NEB等公司；DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(PAA)，转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)，超纯质粒提取试剂

7、盒（Qiagen）.　　1.1.2质粒、菌株、细胞系等AdenoXTMAdenoviralExpressionSystems(BD.Clontech):包括有pShuttle2,pShuttle2laZ,AdenoXTMViralDNA等，重组质粒pcDNA3.1（+）HIF1α(突变型)(本室构建)，大肠杆菌DH5α（本室保存），HEK293细胞（中科院上海细胞所）.　　1.1.3引物HIF1αcDNA片段引物（由博亚公司设计并合成），上游引物：5′GACACAGAAGCAAAGAACCC3′，下游引物：5′TCAAAGCGACAGAT

8、AACACG3′，PCR产物片段长460bp.BD.Clontech所提供引物（两个引物分别与穿梭质粒表达盒及骨架质粒的部分序列结合），上游引物：5′TAGTGTGGCGGAAGTGTGATG