细胞凋亡在颌骨骨折愈合过程中的发生及意义

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1、细胞凋亡在颌骨骨折愈合过程中的发生及意义更新日期：2011-07-22司晓辉　金岩　杨连甲一、材料与方法　　1.主要材料和试剂：健康成年雄性家兔（1.6～2.2kg）24只，由本校动物中心提供；TdT-mediateddUTPnickendlabeling(TUNEL)kit购自美国Oncor公司。　　2.骨折模型建立及标本处理：用质量浓度为30g/L的戊巴比妥钠对家兔行全麻（1ml/kg），于家兔单侧下颌骨角前切迹处用牙科涡轮机造成完全性骨折，钢丝结扎固定，逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤。分别于术后第1，3，5，7，11，14，21和28天取材（每个时间点3只动物），

2、取材前用质量浓度为40g/L的多聚甲醛灌注固定，然后取骨断端及其周围组织，4℃后固定4h。常规脱钙，石蜡包埋，切片5μm厚，HE染色。　　3.TUNEL法检测细胞凋亡：切片脱蜡，PBS(14.5g/LNa2HPO4.12H2O,1.48g/LNaH2PO4.2H2O,11.7g/LNaCl,pH7.5)洗5min，蛋白酶K（20μg/ml）37℃孵育15min；PBS洗后，在体积分数为3%的H2O2/PBS中37℃孵育5min；PBS洗后，加25μl平衡缓冲液，37℃孵育1min；加25μlTdT酶，37℃孵育2h后，加37℃预热的中止缓冲液，37℃孵育30min

3、，每10min更换中止缓冲液1次；缓冲液A(12.11g/LTris-HCl,8.78g/LNaCl,pH7.5)洗后，正常羊血清37℃封闭30min；加Anti-DIG-AP，37℃孵育2h；缓冲液A洗后,用缓冲液B(12.11g/LTris-HCl,5.85g/LNaCl,5.05g/LMgCl2.6H2O,pH9.5)洗5min，NBT/BCIP显色30min，脱水，透明，封片。二、结果　　1.HE观察：骨折后第1天，骨断端间隙由血肿充填；第3天血肿开始机化，成纤维细胞、毛细血管芽长入血凝块，形成肉芽组织；第5天，骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增

4、生并逐渐向骨断端移行；第7天，新生骨小梁明显增多，其外周可见成骨细胞；第11天，软骨岛增多，并可见肥大的软骨细胞。膜内成骨活跃，新生骨小梁基本覆盖骨断端；第14天，骨小梁变粗大，形成骨髓腔，可见较成熟的骨组织；第21，28天，骨折处新骨连接成片，趋向于连接骨断端及封闭外界与骨髓腔的交通。　　2.细胞凋亡检测：阳性细胞的胞核呈紫蓝色颗粒。骨折后第1天，血肿区内偶见阳性细胞；第3天，阳性细胞有所增加；第5天，骨折部位细胞成分明显增多，凋亡细胞也较前增多；第7天，在类似于发育的细胞凝聚区内凋亡细胞数增加，而新生骨小梁处偶见凋亡细胞；第11天，软骨区内细胞皱缩，见较多的凋

5、亡细胞；第14天，凋亡细胞明显减少，新骨内可见少量骨细胞呈阳性；第21，28天，新骨处于改建更新过程，偶见个别成骨细胞凋亡，与正常骨接近并趋于一致。三、讨论　　在颞下颌关节（TMJ）发育中，下颌髁状突的形态改变及关节下腔的发生均有凋亡参与，若凋亡过程被打乱，最终导致TMJ功能障碍或先天畸形［1］。骨组织生长、代谢和重建也与细胞凋亡密切相关。骨折修复时软骨痂内的软骨细胞通过凋亡而被清除［2］。骨折愈合时的细胞增殖和凋亡同时发生。成人股骨头和髂骨内未见明显的凋亡细胞，而儿童颅盖骨、成人异位骨和骨赘内则见典型的凋亡细胞，且婴儿骨和病理性骨凋亡细胞的分布不同，提示生理性和

6、病理性骨凋亡的发生有差异。　　检测细胞凋亡的方法以TUNEL法较为常用。TUNEL即末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP-X切口末端标记。TdT是一种DNA修饰酶，可催化在DNA片段3'-OH末端合成多核苷酸聚合物的反应，即DNA片段加尾。在此过程中，带有地高辛等标记物的单核苷酸（dUTP）掺入到加尾聚合物中，完成对DNA断裂缺口的标记。TUNEL法可在常规固定的细胞或脱矿的组织切片上进行原位标记，是一种简便、快速、灵敏度和特异性都较高的方法。笔者用此方法观察到，在骨折后第5天和第11天,凋亡细胞明显增加。第5天为骨折愈合的膜内成骨期，此时骨断端附近的细胞

7、处于去分化状态，增殖明显。在细胞去分化达到高峰时，凋亡细胞也达到最多，提示细胞增生和凋亡这两个过程是协调发生的，而在细胞分化和成熟期，凋亡细胞数量也减少；第11天处于软骨形成期，软骨细胞逐渐肥大退化，在这一时期无坏死发生，而是通过凋亡使得无用的软骨细胞从损伤部位被有序清除，为以后的软骨骨化作准备。(本文编辑：蒋伟)■作者单位：司晓辉（西安，第四军医大学口腔医学院病理科　710032）　　　　　金岩（西安，第四军医大学口腔医学院病理科　710032）　　　　　杨连甲（西安，第四军医大学口腔医学院病理科　710032）参考文献：［1］MatsudaS,MishimaK

8、,Yosh