下颌骨骨折愈合过程中sp表达研究

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1、下颌骨骨折愈合过程中SP表达研宄杨辉俊沈时岳邹虹（北京大学深圳医院口腔颂面外科广东深圳518036）【摘要】目的探讨下颌骨骨折愈合过程中SP表达水平的改变。方法用兔作下颌骨骨折的动物模型，分别于骨折前1天及骨折后第1、4、7、14、28天取骨断端组织标木作成石蜡切片并用LsAB法进行免疫组织化学实验，以探讨SP在骨组织，特别是在成骨细胞和破骨细胞中的表达。结果SP在骨组织及其周围软组织中广泛表达；从骨折后第7天出现增强，第14天到第28天表达最强。结论在下颌骨骨折的愈合过程中，SP在骨组织细胞上的表达增强，SP对骨折的愈合过程具有重要作用。【关键词】SP下颂骨骨折愈合免疫

2、组织化学【中图分类号】R782【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）07-0017-02P物质（SubstanceP,SP）是最早发现的神经肽。在颂骨组织中己证实有SP样神经纤维的存在，源于三叉神经节。在骨折愈合过程中，SP样神经纤维发生了非常显著的反应，但SP与骨折愈合组织改建的关系还不十分清楚。木实验用SP受体多克隆抗体，对下颂骨骨折愈合过程中SP在骨组织细胞上的表达进行原位和动态的免疫组织化学研究，以探讨SP在骨折愈合中的作用。1材料和方法1.1动物实验新丙兰大耳白兔30只（体重3.0kg±0.5kg，雌雄不限），随机平均分成6组，

3、第1组不造成骨折，于骨折前1天取组织标木，其余各组用3%戊巴比妥钠（30mg/kg体重＞经耳缘静脉麻醉后，在左侧颌下作切口，分层切开，暴露下颌骨体部中段，用薄双刃砂片在颊侧骨皮质作纵向沟槽，在此处折断下颂骨后，用不锈钢丝作内固定。术后连续3d给予庆大霉素4万单位，每Hi次，以预防感染。分别于骨折后第1、4、7、14、28天处死动物，经左侧颈总动脉灌注4%多聚甲醛后，取其骨折端骨组织块用4%多聚甲醛固定12h，脱钙，作成5μm厚石蜡切片。1.2免疫组织化学实验免疫组织化学染色采用LsAB法。将石蜡切片脱蜡、水化，滴加3%过氧化氢，孵育25min,以阻断内源性过氧化物酶

4、活性。自来水冲，蒸馏水洗。滴加1%胰蛋白酶溶液(pH=7.2)进行抗原修复，37°C,10mine蒸馏水洗，PBS洗,5min,2次。滴加兔血清封闭,37°C，20min。滴加羊抗SP受体多克隆抗体(Sigma，USA),37°C,2hoPBS洗，5min,2次。滴加生物素化兔抗羊单克隆抗体(稀释度1:120),37°C,40min。PBS洗，5min,2次。滴加链亲和素-AB复合物(1:100)，37°C,40min。滴加DAB显色，适吋终止。采用苏木素复染，加拿大胶封片。用已知SP含量较高的正常兔脑组织作为阳性对照片。阴性对照片不加一抗，改加lmol/LPBS缓冲液，

5、其余操作步骤不变。2结果骨折后各组实验动物活动正常，进食良好，手术切口处无红肿、渗血溢脓等感染征象，并顺利愈合。全部实验动物生存良好，无1例死亡。SP在骨组织中广泛表达，存在于骨组织中成骨细胞(Osteoblast，0B)和破骨细胞(Osteoclast,0C)的胞膜上，以及其它骨组织细胞的胞膜上。在骨折周围的软组织中也大量表达(见图)。骨折后第1、4天，邻近骨折线处的骨组织细胞上的SP表达未见明显变化，从第7天开始出现增强，第14天到第28天表达最强。SP在骨组织细胞的胞膜上各部位染色强度均等。阴性对照组骨组织及周围软组织中均无染色，阳性对照片染色较强。图SP在骨折局部

6、各种细胞上广泛表达(LsAB法×100)FigSPiswidelyexpressedinallcellsatthesiteoffracturedbone(LsAB×100)3讨论现代细胞和分子生物学认为，骨折的愈合过程是、多种因素的综合作用的结果，有许多物质的参与，其中包括局部组织细胞的产生和生物信号的传递,以及多细胞介质的产生。局部和全身因素可直接或间接地作用于骨生成细胞，自始至终控制着骨愈合的全过程。所以，成骨细胞在骨折愈合过程中仍然起着重要的和直接的作用。感觉神经肽为感觉神经元胞体合成的一类神经肽，包括P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGR

7、P)、神经肽丫(NY)、K物质等，其中SP与损伤修复关系最为密切。组织损伤可刺激感觉神经末梢储存的SP进入损伤组织，与巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等免疫细胞的特异受体结合，通过刺激免疫细胞释放细胞因子，参与组织修复早期的炎症阶段的调控；SP与成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞细胞相应受体结合，可促进DNA合成和细胞增殖［1］。在骨折愈合过程中，研宄发现SP样神经纤维与毛细血管共同出现在新生骨组织的周围［2】；Sandhu等［3］观察到切断交感神经可促进外周SP释放增加和骨的吸收。其原因可能为切断交感神经后使得交感神经对所支配