牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）的论文

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1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）的论文　　本实验表达的his-fima融合蛋白主要用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，因此需求量较大，而且不用考虑靶蛋白是否具有活性。本实验所表达的his-fima融合蛋白主要位于包涵体中，这种以包涵体形式表达的蛋白很稳定，不易被降解。这样在下一步实验纯化fima蛋白时，可以在变性条件（使用变性剂8m尿素或者6m的胍盐酸）下溶解包涵体，以便于使用co2+柱亲和层析得到纯化的靶蛋白。　　本实验所使用的大肠杆菌bl21(de3)plyss所带plyss具有氯霉素抗性。在将重

2、组质粒和空质粒转化入宿主菌时，不需要使用iptg进行蓝白筛选，因为pet-15bvector含有氨苄青霉素抗性基因，转化了重组质粒和空质粒的bl21(de3)plyss同时具有氯霉素和氨苄青霉素抗性，而未转化的菌珠只有氯霉素抗性，这样就可以使用氨苄青霉素来对转化菌进行筛选。　　本实验用本课题组前期构建的fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima，在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后，fima基因得到正确表达。　　4实验二fima蛋白的纯化与鉴定　　4.1实验材料与仪器　　4.1.1菌珠　　携带有pet-15bvect

3、or和pet-15b-fima的大肠杆菌bl21(de3)plyss：实验一获得。　　4.1.2主要试剂　　1）bca法蛋白定量试剂盒：碧云天公司　　2）talon纯化试剂盒：clontechlaboratories,inc,usa　　3）其他：同实验一　　4.1.3实验仪器　　1）宝特elx-800酶标仪：宝特仪器有限公司　　2）其他：同实验一　　4.2实验方法4.2.1样品制备　　按照talon纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下：　　1）在转化了质粒pet-15b-fima的lb固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5ml

4、amp+(100μg/ml)的lb培养液中，37℃振摇过夜。.　　2）将5ml过夜菌转接于500mllb(amp+)培养液中，37℃振摇4h；加入iptg致终浓度为2mmol/l，37℃振摇3h。　　3）4℃，5500r/min离心20min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。　　4）用buffera（ph7.0）重悬细胞沉淀物，每25ml细胞培养物使用2ml缓冲液。　　5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。　　6）4℃，10000～12000r/min离心20min以去除不溶性杂质。　　7）小心的转移上清液到一个干净的离心

5、管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。　　4.2.2分批/重力流柱子纯化fima蛋白　　按照talon纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下：　　1）彻底重悬talon树脂。　　2）快速转移3ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700g离心2min，弃上清。　　3）加入10倍柱床体积的buffera（ph7.0），小心混匀以平衡树脂，700g离心2min，弃上清。　　4）重复步骤3。　　5）加入4.2.1所制备的样品。　　6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20min，700g离心5min。　　7）小心移除尽可能多的上清液，注意不

6、要触碰到沉淀在离心管底的树脂。　　8）用10～20柱床体积的buffera（ph7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10min，以达到更彻底的冲洗效果，700g离心5min，弃上清。　　9）重复步骤8。　　10）加入1倍柱床体积的buffera（ph7.0），重悬混合。　　11）转移树脂到一个2ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。　　12）用五倍柱床体积的加入了8mm的咪唑的buffera（ph7.0）冲洗柱子。　　13）加入5倍柱床体积的bufferb洗脱，按每50

7、0μl一份来收集洗脱产物。　　14）用sds-page的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。　　15）将含有纯化蛋白的洗脱液以bufferc稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析：　　4m尿素→2m尿素→1×pbs＋1mnacl→l×pbs+0.5mnacl　　→1×pbs→0.5×pbs→ddh20　　16）将透析好的蛋白质留出20μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标记置于－70℃保存。　　buffera（ph7.0）：50mmna3po4,,nbsp;8murea(尿素)300mmnacl　　bufferb（

8、ph7.0）：45mmna3po47.2murea(尿素)270mmnacl150mm咪唑　　bufferc（ph7.0）：　　　　100mmnah2po410mmtris-cl　　　　8mu