牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究论文

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1、牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究论文【摘要】目的通过牛蒡子苷对胰腺癌细胞株(CAPAN-1)体内外实验，验证其是否具有抗胰腺癌作用。方法在CAPAN-1细胞培养液中加牛蒡子苷，培养72h并观察癌细胞的增殖抑制率及癌细胞形态变化。流式细胞仪（FCM）检测CAPAN-1细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测CAPAN-1细胞凋亡率；免疫细胞化学检测CAPAN-1细胞的增殖凋亡调控相关蛋白(bax、bcl-2)表达。用CAPAN-1细胞制作Balb/c裸小鼠荷瘤模型，连续每天腹腔注射牛蒡子苷（10mg·kg-1·d-1）10d，以5-FU（30mg·

2、kg-1·d-1）作阳性对照观察抑瘤率。结果牛蒡子苷抑制CAPAN-1细胞生长；阻滞CAPAN-1细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡；通过上调bax蛋白表达（P＜0.01），下调bcl-2蛋白表达（P＜0.05）诱导CAPAN-1细胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠肿瘤生长，抑瘤率为41.7%。结论牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。【关键词】牛蒡子苷；抗肿瘤活性；细胞凋亡；CAPAN-1细胞株Abstract：ObjectiveToevaluatetheanti-tumoreffectandmechanismofarctiinonthehuman

3、pancreascancercell(CAPAN-1)invitroandvivo.MethodsCAPAN-1cellediumcontainingserialconcentrationofarctiinfor72hours.ThenthegroorphologicalchangeeasuredbyTUNELmethodandFCM.CellcyclephasedistributioneasuredbyFCM.Theexpressionofproliferationandapoptosisassociatedproteinsofbax,bcl-2inCAP

4、AN-1cellinedusingimmunocytochemistry.CAPAN-1celltumor-bearingnudemiceinisteredarctiinand5-FUandthetumorgroorgroechnnisnmsistoinducecellapoptosis.Keyoreffect；Apoptosis；CAPAN-1cellline牛蒡子是具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的中药.freell(细胞浓度约为6.5×103个·ml-1)，接种于直径35mm的培养皿中。随机分为用药组和对照组。用药组分别加入用0.02%二甲亚砜溶解的牛

5、蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；对照组加入0.02%二甲亚砜。每一浓度3个重复培养皿，培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数，设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率。增殖率（%）=［（用药组各时段癌细胞数－用药组开始癌细胞数）/（对照组各时段癌细胞数－对照组开始癌细胞数）］×100%。2.2癌细胞形态学观察倒置显微镜下动态观察培养皿中CAPAN-1细胞用药前后的变化。2.3FCM细胞周期检测收集对照组和加牛蒡子苷1μg·ml-1的用药组培养24，48，72h的CAPAN-1细胞；PBS洗涤后，4℃下用75%酒精固定1

6、2h以上；离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg·ml-1RNA酶溶液150μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龙网过滤后4℃下放置15min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。2.4DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测细胞凋亡在培养皿中放置盖玻片，CAPAN-1细胞在盖玻片粘壁生长后，用药组加入1μg·ml-1牛蒡子苷，收集对照组和用药组培养24，48，72h附细CAPAN-1胞的盖玻片，按TUNEL试剂盒标记染色，结果判断：以细胞核内出现棕褐色为阳性。光镜下计算凋亡指数（Apoptoticindex,AI）

7、。AI是指每张TUNEL玻片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比。2.5免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax及bcl-2的蛋白表达分别收集对照组和加牛蒡子苷1μg·ml-1的用药组培养48h的CAPAN-1细胞，用S-P法进行染色。小鼠bax单克隆抗体按1∶200稀释，bcl-2单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断：细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数（labelingindex，LI），重复3次，取均值。LI=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。2.6荷瘤Balb

8、/c裸小鼠肿瘤抑制实验体重21g左右的雌性Balb/