牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究

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1、牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究【摘要】目的通过牛蒡子苷对胰腺癌细胞株(CAPAN-1)体内外实验，验证其是否具有抗胰腺癌作用。方法在CAPAN-1细胞培养液中加牛蒡子苷，培养72h并观察癌细胞的增殖抑制率及癌细胞形态变化。流式细胞仪（FCM）检测CAPAN-1细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测CAPAN-1细胞凋亡率；免疫细胞化学检测CAPAN-1细胞的增殖凋亡调控相关蛋白(bax、bcl-2)表达。用CAPAN-1细胞制作Balb/c裸小鼠荷瘤模型，连续每天腹腔注射牛蒡子苷（10mg·kg-1·d-1）10d，以5-FU（30mg·kg-1·d-1）作

2、阳性对照观察抑瘤率。结果牛蒡子苷抑制CAPAN-1细胞生长；阻滞CAPAN-1细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡；通过上调bax蛋白表达（P＜0.01），下调bcl-2蛋白表达（P＜0.05）诱导CAPAN-1细胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠肿瘤生长，抑瘤率为41.7%。结论牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。【关键词】牛蒡子苷；抗肿瘤活性；细胞凋亡；CAPAN-1细胞株Abstract：ObjectiveToevaluatetheanti-tumoreffectandmechanismofarctiinonthehumanpancreascancercell

3、(CAPAN-1)invitroandvivo.MethodsCAPAN-1cellediumcontainingserialconcentrationofarctiinfor72hours.ThenthegroorphologicalchangeeasuredbyTUNELmethodandFCM.CellcyclephasedistributioneasuredbyFCM.TheexpressionofproliferationandapoptosisassociatedprotEinsofbax,bcl-2inCAPAN-1cellinedusingimmunocyt

4、ochemistry.CAPAN-1celltumor-bearingnudemiceinisteredarctiinand5-FUandthetumorgroorgroechnnisnmsistoinducecellapoptosis.Keyoreffect；Apoptosis；CAPAN-1cellline牛蒡子是具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的中药，且常用于抗癌方剂中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚A、B（lappaolA,B）、脂肪油等［1］。近来研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在动物体内实验中具有抗癌活性［2～

5、4］。牛蒡子苷对CAPAN-1细胞是否具有抑制作用尚无报道，为进一步研究牛蒡子苷的抗肿瘤活性，利用CAPAN-1细胞进行体内外实验，探讨牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用机理。1材料牛蒡子苷购于中国药品生物制品检定所；CAPAN-1细胞株由上海细胞研究所提供；FCS-1640细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（GIBCo）；SP免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl-2及bax单克隆抗体（SantaCruzCo）。2方法2.1牛蒡子苷对CAPAN-1细胞生长的影响取FCS-1640细胞培养液中对数生长期的CAPAN-1细胞3ml(细胞浓度约为6.5×103个·ml-1)，接

6、种于直径35mm的培养皿中。随机分为用药组和对照组。用药组分别加入用0.02%二甲亚砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；对照组加入0.02%二甲亚砜。每一浓度3个重复培养皿，培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数，设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率。增殖率（%）=［（用药组各时段癌细胞数－用药组开始癌细胞数）/（对照组各时段癌细胞数－对照组开始癌细胞数）］×100%。2.2癌细胞形态学观察倒置显微镜下动态观察培养皿中CAPAN-1细胞用药前后的变化。2.3FCM细胞周期检测收集对照组和加牛蒡子苷1μg·ml-1的用药组培养

7、24，48，72h的CAPAN-1细胞；PBS洗涤后，4℃下用75%酒精固定12h以上；离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg·ml-1RNA酶溶液150μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龙网过滤后4℃下放置15min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。2.4DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测细胞凋亡在培养皿中放置盖玻片，CAPAN-1细胞在盖玻片粘壁生长后，用药组加入1μg·ml-1牛蒡子苷，收集对照组和用药组培养24，48，72h附细CAPAN-1胞的盖玻片，