野黄芩苷对洋刀豆脲酶的抑制作用及其机理研究

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2、州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名丕堡数文导师签日期：,2014年占月2日摘要目的：野黄芩苷，又名灯盏花乙素，是存在于天然植物中的一种黄酮类化合物，为中药灯盏细辛(Erigeronbreviscapus(Vant．)Hand．一Mazz．)及其提取物灯盏花素的主要活性成分。野黄芩苷具有保护心脑血管、抗炎、抗肿瘤、保护视神经等生物活性，临床上常用于治疗肾病、肝功能损害、青光眼及心、脑血管疾病等。研究

3、证明，多个黄酮类化合物具有良好的脲酶抑制作用，且其抑制作用强弱与其酚羟基数目及位置密切相关，而野黄芩苷为多羟基黄酮类化合物，但其对脲酶的抑制作用及相关机制的研究尚未见报道。本文以野黄芩苷为研究对象，首先通过分子对接研究，探讨对洋刀豆脲酶的可能作用；通过测定野黄芩苷对洋刀豆脲酶的半数抑制浓度(IC50)、动力学研究、作用位点分析考察野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的效果及可能的作用机理，为野黄芩苷的生产应用开辟新的领域，也为脲酶抑制剂的开发提供新的思路及基础研究资料。方法：1分子对接研究：采用分子对接软件Auto—Dock4．0，分析

4、野黄芩苷与洋刀豆脲酶可能的相互作用。2利用洋刀豆脲酶的活性与水解能力的相关性，采用公认的氨态氮的定量分析方法．靛酚蓝显色法，建立定量评价洋刀豆脲酶活性的方法。3野黄芩苷对脲酶活性的抑制研究：通过孵育时间考察野黄芩苷与洋刀豆脲酶的验最佳孵育时间，并通过半数抑制浓度实验，探讨野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的作用效果。4动力学研究：运用Lineweaver-Burkplot双倒数作图法求得洋刀豆脲酶酶促反应的动力学参数米氏常数KM与最大反应速率vm似，进而通过抑制动力学曲线实验，分析野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶的动力学作用类型，并求得两者之间

5、相互作用的动力学抑制常数。5抑制位点分析：通过脲酶活性保护试验，洋刀豆脲酶．含巯基化合物．野黄芩苷三者之间的加入顺序考察试验，洋刀豆脲酶的再活化试验，阐明野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶的作用机理。结果：1洋刀豆脲酶与野黄芩苷分子对接研究分子对接研究显示，野黄芩苷与洋刀豆脲酶Flap区域上的氨基酸残基总共形成8个氢键，其中与CME一592共形成3个氢键，且形成的氢键作用最强。综合结果推测，其抑制洋刀豆脲酶的活性可能是通过限制Flap区域的构象变化，从而导致催化水解反应无法顺利进行。2对洋刀豆脲酶活性抑制作用研究(1)野黄芩苷与洋刀豆脲酶

6、进行恒温孵育时，剩余酶活性逐渐下降并与孵育时间呈一定程度的负相关趋势。洋刀豆脲酶在与各浓度野黄芩苷恒温孵育的前10min内，其活性呈快速下降趋势，两者快速达到游离脲酶、游离野黄芩苷及脲酶．野黄芩苷复合物三者平衡状态，故两者的孵育时间对洋刀豆脲酶的抑制作用影响不明显。(2)野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的IC50=1．35±0．15mM(R2=0．9749)，与强抑制剂槲皮素的IC50=0．617±0．019mM(尺2=0．917)相比较，其抑制效力虽不及槲皮素强，但二者的半数抑制浓度处于同一数量级。3抑制动力学曲线研究在没有抑制剂

7、野黄芩昔的存在下，洋刀豆脲酶酶促反应的米氏常数KM为7．10-4-0．10mM，最大反应速度"lJmax为1．15-4-0．04mM／min。分析野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶的反应进度曲线，野黄芩苷先以抑制常数墨=5．37×lO_2mM与洋刀豆脲酶迅速结合成脲酶．野黄芩苷过渡态，其后以抑制常数膨‘=3．49×10-3mM缓慢地进行异构化，形成更稳定的脲酶．野黄芩苷复合物。综合孵育时间考察、抑制动力学曲线研究相应的结果分析，推断野黄芩苷抑制洋刀豆脲酶的类型属于缓慢结合型(slow-binding)。4对洋刀豆脲酶抑制位点研究(1)野黄

8、芩苷通过作用洋刀豆脲酶巯基活性部位，抑制脲酶的活性。(2)野黄芩苷．含巯基化合物一洋刀豆脲酶三者相互作用时，野黄芩苷与洋刀豆脲酶中巯基基团的亲和力较与其含巯基化合物中巯基基团的亲和力小。(3)二硫苏糖醇(DTT)可使受野黄芩苷抑制的洋刀豆脲酶恢复活性，提示野黄芩苷对洋刀豆脲酶