植物组织培养实验指导

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1、《植物组织培养》实验指导书实验性质：设计性武汉工业学院生物科学与制药工程系《生物工程实验》课程组编写二零零五年六月植物组织培养实验性质：设计性实验学时：8分组人数：2人1.1实验目的和要求（1）了解植物细胞和组织培养技术的定义和基本要求（2）熟悉无菌操作的要求，初步掌握无菌操作技术（3）初步掌握常规的植物组织培养技术1.2实验原理细胞分化(celldiferentiation)指细胞后代在形态、结构和功能等发生变化的过程，归根结底是某些功能基因的开启或者关闭。一般说来，终端分化细胞已经失去分化潜能，只具有单能性；而大部分细胞只保留了部分分化潜能，称为多能性。对于动物而

2、言，只有部分干细胞仍保留了分化的全能性。而植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物细胞的全能性(totipotency)。植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养最原始的意义是指愈伤组织培养，但发展至今，其范围已经扩展至植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养：植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养。胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，

3、茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层，胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织培养。细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的

4、第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。制备外植体的原则是无菌和有活性，无菌是外植体植被的要求，有杂菌带入培养基会造成微生物污染，而阻滞甚至杀死外植体。有活性是外植体制备的前提，无活性的外植体的培养在植物组织培养中是无意义的。无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的，实验室中经常使用的无菌操作设备是超净工作台。无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键，通常进行无菌操作的实验人

5、员也要经过严密的无菌操作训练并建立严格的“无菌概念”。能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境。人工培养环境是整个组织培养的难点和重点，也是近百年来植物生理学家一直探讨和研究的重要话题。人工培养环境包括能量的来源——光照，新陈代谢的保证——温度，气-水平衡——湿度，生物原料的来源——培养基。这与植物的自然环境是类似的，即光照、温湿度和土壤。光照、温度的选定通常依据所培养植物的生态习性，习惯上采用暗培养与光照培养(8h/d,3000lx)的结合，温度在25-28度。湿度在组织培养中不需特意的调整，因为培养容器中的湿度几乎达到100%。如此说来，人工培养

6、环境的重难点自然而然地落在了培养基上。培养基(Culturemedium)是从无土栽培的营养液发展而来的，在某种意义上说就是模拟土壤。最初的培养基就是简单的马铃薯浸出液即土豆汁。后来随着植物生理学和生物化学的研究的深入，培养基越来越复杂，成分越来越多。当支持物(如：琼脂、明胶)的发现并且应用到培养基的培养基中时，固体培养基随之诞生。固体培养基是组织培养基中最常用的一种培养基的类型。人工合成培养基通常包括大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、支持物和植物激素。大量元素和微量元素通常使用无机盐代替，铁盐通常以螯合铁的形式出现，有机复合物通常包括氨基酸、代谢载体和维生素

7、等，糖可采用蔗糖或者葡萄糖，支持物一般采用高分子交联糖链(如聚半乳糖硫酸酯)，这几类物质的用量和配比在多少年的发展中已经基本上形成了若干个模板，例如实验室中常用的MS、B5、Nicher培养基。植物激素，是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素，也是人工调控组织培养的“魔术棒”。几乎所有的植物组织培养工作者都认同植物激素在组织培养中具有无可动摇的核心地位。植物激素包括五大类：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中很重要，即所谓的“激素杠杆”。