2 水解酶及氧化还原酶组织化学

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1、§水解酶及氧化还原酶组织化学§原理及方法§水解酶hydrolases§指催化底物发生水解反应的酶类§例如:磷酸酶类、酯酶类等AB＋H2OAH＋BOH§磷酸酶类§磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称§水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联而显色。§碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4表现为最大活性§酸性磷酸酶：在pH5.0显示最大活性§显示法：•金属沉淀法•偶氮耦联法§碱性磷酸酶alkalinephosphatase,AKP、ALP§在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解。§磷酸和R能用组化方法捕获。•钙钴法：捕获磷酸•偶氮

2、耦联法：当R为萘酚衍生物时，捕获R•二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察。§激活：金属离子—Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+§抑制：Tetramisol(四咪唑)、各种醇类、L-半胱氨酸§钙钴法（金属沉淀技术）Gomori-Takamatus法§原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生沉淀•β-甘油磷酸钠（底物）─→磷酸离子•磷酸离子+Ca2+─→磷酸钙（不可见）•磷酸钙+Co2+─→磷酸钴（不可见）•磷酸钴+S2-─→硫化钴（不溶，可见）§条件：pH9.4§作用液：•2%巴比妥钠•3%β-甘油磷酸钠•2%无水氯化钙•2%MgSO4.7H2O§步骤：

3、•新鲜恒冷箱切片，8μ§不固定直接进作用液§FCa（氯化钙Formalin）固定5'-2h，4℃，固定后蒸馏水洗•作用液10-60’，37℃（视组织而定）•流水5’•2%硝酸钴5’•蒸馏水洗•1-2%硫化铵1’（*硫化铵需新鲜配制）•蒸馏水洗•甘油明胶封§结果：黑色的颗粒状沉淀§对照：•去底物（以双蒸水替代β-甘油磷酸钠），结果阴性•进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使酶失活§注意：组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色沉淀，应鉴别（铁反应）§AKP主要存在于•物质交换活跃处：肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、肝毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部的内皮•内质

4、网、高尔基复合体、吞饮小泡肠上皮的溶酶体、中性粒细胞的中性颗粒，平滑肌细胞膜§是细胞膜的标志酶之一§骨肉瘤内有丰富的AKP§偶氮耦联法§原理：磷酸萘酯经酶水解放出萘酚，立刻为重氮盐捕获而成为有色不溶的偶氮染料。α-萘酚磷酸钠α-萘酚α-萘酚重氮盐（固蓝RR）偶氮染料§Lojga改良Burstone偶氮耦联法§作用液•萘酚AS-SI磷酸钠•DMSO(二甲基亚砜)•六偶氮对品红§A液：盐酸对品红400mg，蒸馏水8ml，浓盐酸(36%)2ml混合溶解过滤§B液：4％亚硝酸钠液§临用前A、B液等量混合•Tris-HCl缓冲液（pH8.2~9.2）§步骤：•小块

5、组织用液氮骤冷，恒冷箱切片§固定FCa5分钟，4℃，固定后蒸馏水洗§不固定•作用液5-60’，37℃或室温•蒸馏水洗•4%甲醛固定15’-2h，室温•自来水洗，蒸馏水洗•1%甲基绿（氯仿洗过）5-10分钟，蒸馏水洗•（1）甘油明胶封•（2）丙酮-丙酮甲苯-甲苯-DPX封§结果：酶活动处出现红色无定形的沉淀，核呈蓝绿色，对比明显§*重氮盐也可用固蓝B盐,这种酶的反应活性部为紫黑色，核的对比染色应改用核固红或中性红。§钙钴法和偶氮耦联法比较§钙钴法操作简单，但会出现假阳性现象§偶氮耦联法的保温时间短，方法比较灵敏；在正常组织中无萘酚，不会出现假阳性，故不需对

6、照切片；反应产物为偶氮染料，较磷酸钙更难溶解，定位好，不易扩散，图象清晰，并可控制反应深度§酸性磷酸酶（ACP）§ACP是在酸性范围里水解磷酸单酯，游离出磷酸的酶§最适pH为4.5-5.5§Gomori铅法§作用原理同AKP。因磷酸钙在酸性pH溶解，故用硝酸铅作为捕获剂，再用硫化氢直接把磷酸铅转变为硫化铅，最后形成棕黑色硫化铅沉淀。§激活剂：Mn2＋§抑制剂：氟化钠、磷酸根离子§对照：去底物；抑制酶§作用液•巴比妥醋酸缓冲液（PH5.0）　　20ml•3%β-甘油磷酸钠　　　　　　　2ml•硝酸铅　　　　　　　　　　　24mg•用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸

7、铅，然后再加入3%β-甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其PH值，如不足或高于，都应调校至5.0。§步骤•恒冷箱冷冻切片，附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干30分钟后，用纯丙酮固定5-10分钟。•蒸馏水轻洗。•将切片于作用液中孵育30-120分钟（37℃）。•蒸馏水冲洗1分钟。•1%冰醋酸水溶液浸洗30秒钟。•蒸馏水冲洗1分钟。•1%硫化铵水溶液处理1分钟。•流水冲洗后再入蒸馏水洗。•核固红染核5分钟。•流水洗5-10分钟。•常规脱水、透明并封固。§结果：细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。§偶氮耦联法§作用原理同AKP。§因为许多重氮盐在pH5.

8、0时，不能与α-萘酚偶联；或在pH5.5时虽可偶联，但水解的速度大于耦联速度而造