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1、内质网氧化还原酶 0引言 内质X应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)是指在多种生理或病理条件下细胞内质X钙稳态失衡或蛋白质加工运输障碍、生理功能发生紊乱的一种亚细胞器的病理过程[1-3],涉及内质X类似激酶(proteinkinaseRNA-likeendoplas-micreticulumkinase,PERK)/真核细胞翻译起始因子2α(eukaryoticinitiationfactor2α,eIF2α)、激活转录因子6(activatingtranscriptionfactor6,
2、ATF6)和需肌醇酶-1(inositol-requiringkinase1,IRE-1α)/X盒结合蛋白-1(X-boxbindingpro-tein-1,XBP-1)等信号通路[4-6],而葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78)是细胞ERS状态的标志物[7,8].内质X氧化还原酶-1α(endoplasmicreticulumoxidoreductin1α,ERO1α)是调控内质X腔中蛋白合成、折叠的关键基因[9,10].同型半胱氨酸(homocyste-ine
3、,Hcy)是多种疾病的危险因子,可引起肝脏ERS[11,12].本研究主要探讨Hcy诱导肝细胞ERS过程中ERO1α的调控作用及可能机制,为进一步寻找Hcy致肝脏ERS中的作用靶点提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料HL7220肝细胞株(四川大学华西医学中心,中国);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司,中国);CO2培养箱(Heraeus,德国);5415D型微量台式离心机(Eppendorf,德国);BS110S型精密天平(Sartorius,德国);荧光显微镜(奥林巴斯公司,日本);荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司,中国);
4、垂直电泳仪和Model680全自动酶标仪(Bio-Rad公司,美国);HyCloneRPMI1640培养基(Thermo);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);Hcy(Sigma);RNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司,中国);逆转录和qRT-PCR试剂盒(美国Invitrogen公司);蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,中国);ERO1α兔抗人一抗(Abcam公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司,中国);GRP78、PERK、ATF6、XBP-1ELISA试剂盒(北京
5、雅安达公司,中国);引物由上海生工生物工程有限公司合成. 1.2方法 1.2.1细胞培养:将人肝细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基置于37℃、50mL/LCO2培养箱中传代培养.细胞密度达到80%左右时,用终浓度为0、50、100、200、500μmol/LHcy和100μmol/LHcy+叶酸+VB12干预,其中0μmol/LHcy为对照组,48h后收集细胞,用于后续试验. 1.2.2ELISA检测ERS相关蛋白GRP78、PERK、ATF6、XBP-1的水平:ELISA试剂盒室温平衡15min,分别设空白孔、待测样品孔.
6、空白孔加样品稀释液100μL,余孔分别加标准品或待测样品100μL(待测样品蛋白上样浓度统一为21g/L),37℃反应30min.洗板5次,各1min,拍干.每孔加酶标液100μL,37℃反应30min,洗板5次,各1min,拍干.加显色试剂A液和B液,37℃显色15min.加终止液,15min内,酶标仪上读取各孔A450值. 1.2.3实时定量PCR检测ERO1αmRNA水平:按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性.按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA;采用Primer5.0软件设计引物,
7、ERO1α:5'-ATCCTTTG-GCTTCTGGTCAAG-3'(上游)和5'-GTTGT-GTCCCCATTTCTTTTCT-3'(下游);β-actin:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'(上游)和5'-CTGGAAGGTGGACAGCGACG-3'(下游). PCR条件:94℃预变性10min,94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延长30s,扩增40个循环.待反应结束后,结合扩增曲线及溶解曲线,选择符合要求的qRT-PCR原始数据,结果用2
8、-△△CT法分析. 1.2.4200
