pcr enzymes 的选用

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1、宝生物工程（大连）有限公司,116600TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.PCREnzymes的选用(PCR:PolymeraseChainReaction)PCR法原理Step1：双链DNA热变性（94℃）；Step2：引物与模板单链DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反应（72℃）；Step4：扩增的双链DNA再次热变性（返回Step1）。（Step1～3称为一个循环，如此循环往复25～30次）PCR反应五要素●模板DNA●PCR用引物●PCR用DNA聚合酶●P

2、CR用Buffer●dNTPPCR反应存在问题1.可信度（Fidelity）：PCR反应过程中的错配（Misincorporation）现象，给克隆、变异导入带来麻烦。2.PCR扩增的特异性：非特异性扩增往往给实验带来麻烦。3.扩增的DNA长度：一般扩增1～2kbp以下的DNA片段。4.扩增的DNA量：对有些检测、克隆实验，DNA量往往达不到要求。5.PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时，PCR扩增困难。6.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。●LAPCR技术●LAPCR(Lo

3、ngandAccuratePCR）技术的关键是使用具有3’→5’Exonuclease活性（Proofreading活性）的耐热性DNA聚合酶。原理见右图。●HotStartPCR技术●第一步PCR反应的升温期（----部分），控制DNA聚合酶使其不发生作用。抗体作用原理图Taq酶抗Taq酶抗体抗原抗体结合Taq酶活性恢复94℃加热，抗体失活●HotStartPCR技术●RealTimePCR技术ForwardPrimerReversePrimer荧光发光报告基团淬灭基团DNA模板DNA模板荧光淬灭PCR扩增时，荧

4、光探针分解，荧光发光TaqPolymerase(5’→3’Exonuclease)(TaqMan探针法)TaKaRaPCREnzymes种类1.TaKaRaTaqTMTaKaRaTaqTMHotStartVersion2.TaKaRaExTaqTMTaKaRaExTaqTMHotStartVersionTaKaRaExTaqTMR-PCRVersion3.TaKaRaLATaqTM4.PyrobestTMDNAPolymerase5.TaKaRaZ-TaqTMTaKaRaTaqTM●特点1.进行1～2kbp以下的D

5、NA片段的PCR扩增。2.比较经济的PCR用DNA聚合酶。3.适用于一般的PCR扩增或检测。●特点1.进行1～2kbp以下的DNA片段的PCR扩增。2.适用于一般的PCR扩增或检测。3.进行HotStart法PCR扩增，增加PCR扩增的特异性。TaKaRaTaqTMHotStartVersionTaKaRaTaqTM扩增例扩增例TaKaRaTaqTMHotStartVersion1.TaKaRaTaq2.TaKaRaTaq3.TaKaRaTaqHSVer.4.TaKaRaTaqHSVer.M.100bpLadder

6、MarkerTaKaRaExTaqTM●特点1.进行15kbp以下的DNA片段的PCR扩增。2.融合了LAPCR技术。3.保真性是TaKaRaTaqTM的3～4倍。4.从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性考虑，是一种多用型的PCR用DNA聚合酶。5.HotStartVersion可进行HotStart法PCR扩增，增加PCR扩增的特异性。TaKaRaExTaqTMHotStartVersionTaKaRaExTaqTM扩增例扩增例TaKaRaEXTaqTMHotStartVersion1.TaKaRaEXTaq

7、2.TaKaRaEXTaq3.TaKaRaEXTaqHSVer.4.TaKaRaEXTaqHSVer.M.100bpLadderMarker●特点融合了LAPCR技术，增强了PCR扩增性能，提高了PCR扩增灵敏度。2.具有5’→3’Exonuclease活性。3.使用了Taq抗体，可进行HotStart法PCR扩增，增加了PCR扩增特异性。TaKaRaExTaqTMR-PCRVersion荧光信号值（Y轴）与循环圈数（X轴）的扩增曲线图起始模板量对数值（Y轴）与Ct值（X轴）的标准定量曲线图扩增例(TaqMan探针

8、法)TaKaRaEXTaqTMR-PCRVersion荧光信号值（Y轴）与循环圈数（X轴）的扩增曲线图扩增例(SYBRGreenI嵌合荧光法)TaKaRaEXTaqTMR-PCRVersion扩增产物融解曲线图●特点TaKaRaLATaqTM1.进行10kbp以上的DNA片段的PCR扩增。2.融合了LAPCR技术。3.保真性是TaKaRaTaqTM的7倍。4