elisa检测甲胎蛋白

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1、实验设计ELISA一步法检测甲胎蛋白试验精密度分析一、实验原理：1、用抗-AFP单克隆抗体包被反应板，加入标准品和辣根过氧化物酶标记的抗-AFP多克隆抗体，然后进行温育、洗涤，形成复合物，加入底物，显色，用酶标仪检测出吸光度。然后对所测得的吸光度值进行精密度分析。2、精密度是在相同条件下，对同一被测物多次测量，每次测量结果之间的接近程度；用标准差（S），变异系数（CV）,组内相关系数（ICC）来衡量一组平行测定值的精密度。二、实验材料1、实验仪器：加样器（20ul，50~250ul）、恒温箱或恒温水浴箱、洗板机、酶标仪、

2、吸咀、吸水纸（或卫生纸）、消毒缸，垃圾桶。2、实验试剂:甲胎蛋白（AFP）定量检测试剂盒（抗—AFP单克隆抗体的微孔板、酶结合物试剂、AFP标准品120ng/ml、标准品2400ng/ml、浓缩洗涤液、显色剂A显色剂B、终止液、封板膜）三、实验方法1）用前30分钟从冰箱中取出试剂和待测标本，恢复至室温。2)将恒温箱或恒温水浴箱调至反应温度37C0。3）将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水稀释至500ml后备用。4）编号：将微孔按序编号。AFP标准品120ng/ml和AFP标准品2400ng/ml各20孔。5）加样:加入标准品和辣根过

3、氧化物酶标记的抗-AFP多克隆抗体各50ul，轻轻振荡摇匀。6）温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。7）洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机每次浸泡20秒5次，最后一次结束后在纸上尽量拍干。8）显色：每孔加显色剂A和显色剂B各50ul或1滴，轻轻振荡混匀，置室温避光显色5分钟，温育10分钟。9）加终止液：每孔加终止液50微升，轻轻振荡混匀。10）比色测定：设定酶标仪主波长为450nm，次波长为630nm(用双波长检测），测定出各孔的吸光度。四、实验结果判断1、标准偏差越小表示精密度越好。（分为优、良、中、差）2、变异系

4、数越小表示精密度越好，且变异系数<15%。3、计算组内相关系数（ICC），-------ICC表示测量对象个体差异的方差占总方差的比例，0≦ICC≦1，ICC越接近1，说明个体差异对总方差的影响越大，测量误差对总方差的影响越小。一般认为ICC≧0.75时，说明测量结果的可重复性较好。五、实验计算及统计学处理标准差（s）=变异系数（CV）=组间均方（MSa）=组内均方（MSe）=组内相关系数（ICC）=六、质量控制如何做室内质量控制？1.对所选的标准液进行校准。2.对所使用的方法（包括标准分析方法）自行配置标准物和选用质控

5、样品进行方法精密度和准确精密度的准确测定，通过标准物稳定性的观察，使用频繁的方法绘制质量控制图。七、注意事项1、使用前试剂应摇匀，滴瓶应垂直滴加，同一厂商不同批次或不同厂商的试剂盒中各组分不得混用或互换。2、冰箱保存标本在使用前应恢复到室温，轻轻摇匀，若标本有沉淀，应离心去除，并确定未变质才能使用。3、加标本和液体试剂时必须用加样枪，并进行校对其准确性。加入不同标本或不同试剂组分时，应更换加样器吸头，以防止出现交叉感染。4、严格控制每步反应温度和时间，操作应紧凑。5、显色时必须先加底物液后加显色洗液，以免显色过低。6、用

6、酶标仪比色读取结果时，应檫干酶标板底部，且孔内不能有气泡，不要碰触底部的外壁，指印或划痕都可能影响A值。7、封板膜不能重复使用。8、所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。9、终止液为2M硫酸，使用时应注意安全。八、影响因素试剂、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。