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时间:2018-05-08
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1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ在大肠肿瘤中的表达的论文【摘要】目的在蛋白及mrna水平确定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiomeproliferatoractivatedreceptorγ,pparγ)在大肠肿瘤中的表达。方法结肠镜下活检标本,分为正常大肠粘膜组、大肠腺瘤组及大肠癌组,免疫组化及rtpcr方法检测各组pparγ的表达。结果正常大肠粘膜中表达pparγ蛋白的细胞主要是接近肠腔,分化良好的腺上皮细胞;而在大肠腺瘤中,pparγ阳性的细胞呈弥漫分布。pparγ蛋白及mrna在大肠癌中的表达显著增加,明显高
2、于大肠腺瘤和正常大肠粘膜(p<0.05)。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达无差异(p>0.05)。pparγmrna在重度异型增生腺瘤中的表达高于正常大肠粘膜(p<0.05),接近于在大肠癌中的表达(p>0.05)。结论大肠腺瘤最先发生pparγ表达部位的变化,pparγ在重度异型增生的大肠腺瘤及大肠癌中的表达水平较高,表明pparγ可能在早期即参与大肠癌的发生发展。【关键词】过氧化物酶体增殖物激活受体γ大肠腺瘤大肠癌大肠癌多数由大肠腺瘤演变而来,其发生的经典多步骤模式为“腺瘤—腺癌序
3、列”。过氯化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiomeproliferatoractivatedreceptorγ,pparγ)是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型,与消化道肿瘤关系密切。.有研究发现pparγ在大肠粘膜细胞中有表达,本研究旨在蛋白水平和mrna水平确定大肠肿瘤中pparγ的表达情况。1材料与方法1.1材料收集、分组所有组织均取自北医三院消化科结肠镜下活检标本,并经病理诊断证实。正常大肠粘膜15例、大肠腺瘤16例及大肠癌上皮15例行免疫组织化学染色。正常大肠粘膜24例、大肠腺瘤58例(其中重度异型增生
4、大肠腺瘤14例)及大肠癌上皮38例行rtpcr。1.2pparγ的免疫组化染色组织取材后于福尔马林中固定、脱水、常规石蜡包埋、切片(厚4μm)→铺于多聚赖氨酸涂布的载玻片上→常规脱蜡至水→0.1mpbs浸泡5min→抗原修复(0.1m枸橼酸盐缓冲液预热至92℃~98℃,放入玻片,微波炉内92℃~98℃加热5min,自然冷却至室温)→0.1mpbs冲洗5min→3%过氧化氢孵育10min,消除内源性过氧化物酶活性→0.1mpbs冲洗5min→滴加封闭用正常山羊血清(北京中山生物科技公司),室温孵育15min,倾去→滴加1∶20稀
5、释的鼠抗人pparγ单克隆抗体(一抗,santacruz生物技术公司,美国),4℃过夜。→0.1mpbs冲洗5min→滴加生物素标记羊抗小鼠igg(二抗,北京中山生物科技公司),37℃孵育15min→0.1mpbs冲洗5min→滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中山生物科技公司),37℃孵育15min→0.1mpbs冲洗→dab显色,自来水充分冲洗→苏木素复染后封片。阴性对照用正常山羊血清代替一抗。pparγ阳性反应表现为细胞核和胞浆呈棕褐色。每张切片选取3~5个视野,用《真彩色病理图像分析系统4.0》(北航图像中心)对免疫组
6、化染色结果进行分析,计算面密度(阳性目标总面积/统计场总面积),并进行统计。1.3rtpcrtrizol(invitrogen公司)提取组织总rna,适量depc水溶解后,分光光度计(uv1601,shimadzu)测od260及od280的值及电泳测定rna浓度及纯度;各取2μg的rna,impromiirt试剂盒(promega公司)将rna逆转录为cdna;taqdna聚合酶(北京泛基诺科技有限公司)作用下进行pcr反应(pcr仪为geneamp9700,美国appliedbiosyetems公司)。反应条件见表1。
7、阴性对照不加逆转录酶,代以去离子水,余反应条件同前。内参βactin及目的基因pparγ的pcr产物各6μl于1.5%琼脂糖凝胶75v/cm恒压电泳,eb染色后在紫外灯下观察,清晰见341bp和500bp的条带,在imagemaster凝胶成像系统仪(quantity0ne,美国柯达公司)下分析。pparγ与βactin电泳条带灰度的比值代表各组pparγ的表达水平。1.4统计学分析结果用±s表示。采用spss11.0软件分析。计量资料的组间比较采用单因素方差分析,p<0.05认为差异有统计学意义,p<0.01认
8、为差异极具统计学意义。2结果2.1pparγ蛋白在人正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的表达免疫组化结果显示:在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中均有pparγ的表达。正常大肠粘膜组织中表达pparγ的细胞主要是接近肠腔、分化良好的腺上皮细胞,见图1a;而在大肠腺瘤
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