扇贝多肽经smacxiap通路抑制uvb诱导hacat细胞凋亡的作用

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1、扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用：张兰兰苏爱刘颖孙谧王春波杜卫【摘要】目的探讨扇贝多肽（PCF)经半胱天冬酶激活物(Smac）和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)通路对抑制中波紫外线（UVB）诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法实验分为如下6组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42mmol/LPCF组（C组）、UVB+2.84mmol/LPCF组（D组）、UVB+5.68mmol/LPCF组（E组）和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组（F组），分别进行相应处理。分别采用琼脂糖凝胶电泳和Ho

2、chst33258染色法测定各组细胞凋亡率，蛋白印迹法（EM(Gibco公司)、体积分数为0.10的标准胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）、100kU/L青霉素和100kU/L链霉素组成；PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化，纯度>96%，蒸馏水配制成227.5mmol/L的储存液，过滤除菌，4℃保存备用；DNALadder抽提试剂盒、Hoechst33258染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；RNAisoReagent、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；Smac抗体购自eBioscience；XIAP抗

3、体购自CellSignalingTechnologyTM(Beverly,MA,USA)；caspase?3和?9抗体购自北京博奥森公司。XIAP和GAPDH引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；预染蛋白质相对分子质量标准、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；β?actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.1.2仪器紫外线辐照仪（北京师范大学光电仪器厂制造），LeicaDBI4000B荧光显微镜(Leica公司)，PCR仪（美国CLP公司），PROTEANⅡ型垂直电泳仪（美国BIO?RAD公司生产），DYY?Ⅲ8型电泳仪（北京六一仪器厂）

4、。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养与实验分组HaCaT细胞（韩国延世大学丁擘晓博士惠赠）加入完全培养基，置于37℃，体积分数0.50CO2中常规培养。实验分为6组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42mmol/LPCF组（C组）、UVB+2.84mmol/LPCF组（D组）、UVB+5.68mmol/LPCF组（E组）和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组（F组）。将细胞种入置有盖玻片的6孔培养板内培养，细胞融合至50%～80%时，按实验分组进行处理。C、D、E组细胞在含有不同剂量PCF的培养液中预孵育2h后,UVB照射（剂量2

5、0mJ/cm2）；F组细胞在VitC浓度为5.68mmol/L的培养液中预孵育2h后，UVB照射（剂量20mJ/cm2），照射结束后继续常规培养。　　1.2.2Hoechst33258染色检测细胞凋亡各组细胞UVB照射结束后继续培养18h,吸尽各孔培养液，按照Hoechst33258染色试剂盒说明进行操作，荧光显微镜下观察结果。同一处理组随机选择6个观察视野，每个视野观察200个细胞，计数凋亡细胞数，重复3次，计算细胞凋亡率。　　1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡将细胞按实验分组处理后,继续培养18h。然后收集细胞，按照DNALadder抽提试剂盒说明进行操作。

6、将获得的DNA应用20g/L琼脂糖凝胶电泳。　　1.2.4蛋白印迹法（RTreagentkit说明逆转录为cDNA备用。XIAPcDNA引物序列分别为：上游为5′?ATATACCCGAGGAACCCTGCC?3′，下游为5′?TTCCGGCCCAAAACAAAGA?3′，扩增片段长度为245bp；内参GAPDH的引物序列分别为：上游为5′?CGTGGAAGGACTCATGACCA?3′，下游为5′?TCCAGGGGTCTTACTCCTTG?3′，扩增片段长度为509bp。按照PCRAmplificationkit说明进行反应。扩增条件为：95℃预变性3min；94

7、℃40s、60℃40s、72℃40s，循环35次；最后72℃延伸3min。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，实验重复3次。采用凝胶分析软件Quantityone进行半定量分析，XIAPmRNA的表达水平以XIAP与GAPDH比值表示。　　1.3统计学分析　　用SPSS12.0软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析。　　2结果　　2.1PCF抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡作用　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，B组有明显的DNA梯形条带，且梯形带灰度较高，A、F组及加入PCF各组（C、D、E组）均未见明显的梯形条带（图1）。　　图1DNALadder琼脂糖凝

8、胶电泳图（