扇贝多肽经由hf1hsp70ros、nojnk通路抑制紫外线a诱导的hacat细胞凋亡

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1、青岛大学硕士学位论文扇贝多肽经由HF1/HSP70/ROS、NO/JNK通路抑制紫外线A诱导的HaCaT细胞凋亡姓名：王晓雯申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：王春波20120601扇贝多肽经由HSFl／HSP70／ROS、NO、JNK通路抑制紫外线A诱导的HaCaT细胞凋亡摘要目的复制8J／cm2UVA诱导的HaCaT细胞凋亡模型，建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型，从热休克转录因子l(HSFI)／热休克蛋白70(HSP70)／活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)角度，研究扇贝多肽(PolypeptidefromChlamysfa鹏一，PCF)抑制U

2、VA引起的HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法复制8J／era2UVA诱导HaCaT细胞凋亡模型。利用阳离子脂质体(LipefectimeTM2000)法建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型。实验设计为：对照组、UVA模型组、UVA+iNOS特异性抑制剂lmmol／LSMT组、UⅥ针ROS清除剂O．5mmol／LNAC(N-acetyl-L-cysteine，NAC)组、UVA+HSP70转录活性抑制剂501lmol／L槲皮素组、UVA+黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂100pmol／L别嘌呤醇(Oxy)组、UVA+5．69mmol·L．1PCF组、UVA+2．84mmol·L-‘PCF组、UVA

3、+1．42mmol·L．1PCF组。Honechst33258荧光染色观察细胞凋亡率：蛋白质印迹法检测磷酸化HSFI(p．HSF!)、HSP70、iNOS在UVA辐射损伤HaCaT细胞后于细胞内的经时(1、3、6、12、18、24h)变化及6h后JNK、磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达量：Real．TimePCR检测HSFImRNA、HSP70mRNA、XOmRNA的表达；以电子自旋共振法(ESR)同时检测UVA照射后细胞内NO与ROS的经时变化及Oxy、SMT、PCF对NO释放量的影响。结果Honeehst33258荧光染色证实成功复制8J／era2UVA损伤HaCaT细胞后18h的凋

4、亡模型，1．42-5．69mmol／L剂量范围内的PCF与lmmol／LSMT、0．5mmol／LNAC均能够明显抑制UVA引起的HaCaT细胞凋亡(氏O．05)；蛋白经时变化显示P．HSFI于8J／em2UVA照射后3h达高峰(氏O．05)而HSP70表达高峰出现于6h(P<0．05)；UVA辐射前预先加入槲皮素使p-JNK、iNOS、XO的表达量升高，NO、ROS释放量增加且细胞凋亡率增加(P<0．05)；1．42～5．69mmol·L．1剂量范围内的PCF可剂量依赖性抑制提高HSFl的转录活性、增加HSP70蛋白和HSP70mRNA的表达、抑制ROS和NO的生成、降低JNK的活化(P<

5、O．05，P

6、0／ROS、NO、JNKpathwayinhibitingUVA-inducedapoptosisinHaCaTcellsAbstractOBJECTIVETocopy8J／era2UⅥ～-inducedapoptotiemodelofHaCaTcellsandtoestablishiNOStransfectedHaCaTcellstoinvestigatethemechanismofPolypeptidefromChlamysfarreri(PCF)protectingHaCaTcellsfromUVA·inducedapoptosisthroughHSFl／HSP70／ROS，NO，JN

7、Kpathway．METHODS8J／onl2嗍一inducedapoptoticmodelofHaCaTcellswasreplicatedandiNOStransfectedmodelofHaCaTcellsWasestablishedusingofcationicoiposomes(LipefectimeⅢ2000)method．Cellsweredividedasdesigned：controlgro