扇贝多肽调节notgf-βsmad2,smad3smad4通路抑制uvb诱导的hacat细胞凋亡

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1、摘要目的复制20mJ·cm屯UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型、iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型，从诱导型一氧化氮合酶(iNOS)／一氧化氮(NO)角度、转化生长因子D(TGF—D／信号转导分子(Smads)，研究扇贝多肽(PolypeptidefromChlamysfarreri，PCF)抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法复制20mJ·cmlUVB诱导HaCaT细胞凋亡模型。利用阳离子脂质体(LipefectimeTM2000)法建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型。实验设计分组：

2、对照组、UVB模型组、UVB+TGF．D受体抑制剂SB431542组、UVB+iNOS特异性抑制剂SMT组、UVB+NO清除剂Carboxy-PTIO组、UVB+I．42～5．69mmol·L。PCF组、iNOS瞬时转染组。Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡率；Real．TimePCR检测TGF．p、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7mRNA的经时(0、3、6、10、12、15、18、24h)表达；蛋白质印迹法检测TGF-B、p—Smad2／Smad3、iNOS在UVB辐射损伤Ha

3、CaT细胞后细胞内的经时(O、3、6、10、12、15、18、24h)变化。结果Hoechst33258荧光染色检测UVB损伤HaCaT细胞后18h的凋亡率约为40％；mRNA的经时表达显示UVB辐射后Smad2和Smad3表达量与辐射前相比差异无统计学意义(P>0．05)，Smad4mRNA表达于12h开始升高，而Smad7mRNA表达于Oh升高后下降，12h达高峰；蛋白经时变化显示TGF．B于20mJ·cm。2UVB照射后9呼育3h可检测到表达量达峰后下降(P<0．oo，18h达第二次高峰，而p-S

4、mad2／Smad3在UVB照射后孵育3h开始升高，12h，15h蛋白表达量达高峰(P

5、d3的表达量降低(p<0．05)；1．42-5．69mmol-L。PCF可剂量依赖性抑制TGF-p、Smad4mRNA，TGF—p、p-Smad2／Smad3和iNOS蛋白的表达，抑制NO的释放(P<0．05)。结论PCF可抑制20mJ·cm_UVB诱导的HaCaT细胞凋亡，其作用机理是通过调节NO／TGF．13／Smad2，Smad3／Smad4通路。硕士研究生樊洁(药理学)指导教师王春波教授关键词：扇贝多肽(PCF)；紫外线B(U、『B)；一氧化氮合酶(iNoS)／一氧化氮(No)；转化生长因子p(

6、TGF—p)；信号转导分子(Smads)AbstractOBJECTIVEInvestigatethemechanismofPolypeptidefromChlamysfa脚玎(PCF)protectingHaCaTcellsfromapoptosisbyUVBviaiNOS／NO／TGF-13／Smadspathwayby20mJ·cm—UVB．inducedapoptoticmodelofHaCaTcellsandiNOStransienttransfectedHaCaTcells．METHODSU

7、VB-inducedapoptoticmodelofHaCaTcellswasreplicatedandiNOStransienttransfectedmodelofHaCaTcellswasestablishedbyLipefectimeTM2000．Cellswererandomlydividedinto7groups：controlgroup，UVBmodelgroup，UVB+10pmol·L～SB4315429roup，UVB+lmmol‘L～SMTgroup，UVB+100}tmol·L—C

8、arboxy-PTIOgroup，UVB+I．42—5．69mmol·L_PCFgroupandiNOStransienttransfectiongroup．ApoptosisrateofcellswasdeterminedbyHoechst33258staining．ThemRNAexpressionofTGF-D，smad2，smad3，smad4，smad7wereassayedbyRT-PCR．Proteinexpressionle