人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用

《人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用【摘要】目的：研究高密度脂蛋白(HDL)抗内毒素，保护肝细胞作用.方法：用超离心方法分离纯化血浆脂蛋白，建立内毒素血症急性肝衰竭小鼠模型，观察HDL处理后各组肝衰竭小鼠的存活率及主要脏器的组织学改变，RTPCR检测小鼠肝细胞TNFα和IL6mRNA表达水平.结果：HDL对内毒素及半乳糖胺所致小鼠肝衰竭有明显保护作用，治疗组存活率明显高于对照组(85％vs15%)；内毒素血症肝衰竭小鼠肝脏发生了广泛的变性坏死，而HDL治疗组小鼠肝细胞仅发生了轻微变性坏死，单纯无脂蛋白血浆(LFF)则无此保护作用；内毒

2、素小鼠肝组织TNFα和IL6mRNA表达水平增高，HDL治疗组TNFα和IL6mRNA表达水平接近正常.结论：HDL具有抗内毒素血症保护小鼠肝细胞，预防肝衰竭的作用.其作用机制可能是通过降低肝衰竭小鼠TNFα和IL6的过度表达而发挥作的.【关键词】脂蛋白类；内毒素；肝衰竭，细胞因子　　0引言　　高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)颗粒小,蛋白质含量高，主要为apoAⅠ，Levels等［1］报道HDL可以介导细菌内毒素清除和脱毒.内毒素血症与肝损害互为因果，在重型肝炎发病中具有重要作用.但至今临床上尚无真正的抗内毒素药

3、物.我们用人血浆纯化HDL治疗急性肝功能衰竭小鼠内毒素血症，观察其对肝脏的保护作用，并进一步研究其机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　正常人新鲜血浆200mL，密度梯度离心（日立CP100MX型超速离心机）收集密度在1.063～1.21g/cm3的HDL部分，透析浓缩后考马斯亮蓝测定蛋白含量.另外取最底层无脂蛋白血浆部分（LFF，d＞1.21）透析浓缩.HDL纯度鉴定采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为6%，血浆超离心各种脂蛋白层各取25μL加SDS制备样品，点样，恒流20mA，样品进入分离胶后恒流30mA，电泳3h30m

4、in.　　1.2方法　　Babl/c小鼠（购于中国科学院上海实验动物中心）60只，体质量(18±2)g，随机分为3组，每组20只，雌雄各半，每只小鼠ip内毒素LPS（来自大肠杆菌血清型O55∶B5，Sigma）15mg/kg和半乳糖胺（GalN,Sigma）500mg/kg混合液（总体积500μL）.治疗组分别于造模前0.5h及造模后1，2，4h尾静脉ivHDL+LFF（37℃预培育3h）注射剂量HDL40mg/kg，LFF5mL/kg；LFF对照组注射LFF5mL/kg；生理盐水对照组注射等量生理盐水.连续72h观察小鼠存活情况.取小鼠适量肝、脾、肾、

5、肺、心、脑组织用40g/L的甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色.另剪取新鲜瘤组织50mg，加Trizo1（GIBCO公司）1mL，充分匀浆后按照说明书步骤提取总RNA，以其为模板严格按反转录试剂盒（Promega）说明书逆转录合成cDNA后，PCR扩增体系参照文献［2］，以βactin为内参照.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪（GELDOCL1000型）分析，所用引物是根据基因库中小鼠cDNA序列应用Oligo软件自行设计，由上海生物工程公司合成（表1）.表1PCR扩增的引物序列、片段长度、退火温度及循环数　　统计学处理：采用χ2检

6、验.P<0.05认为有统计学意义.　　2结果　SDSPAGE显示各种脂蛋白（VLDL，LDL，HDL）分离完全，表明采用超速离心法从人血浆纯化HDL的纯度和特异性均好.　　2.1HDL对小鼠肝衰竭的保护作用　　HDL+LFF具有显著抗内毒素及半乳糖胺致死作用，而单纯LFF抗致死作用不明显.各组小鼠死亡率分别为：模型组为85%，LFF对照组为80%，HDL治疗组15%（χ2=13.65，P<0.001）.模型组小鼠肝细胞混浊肿胀，大量肝细胞坏死，肝窦及汇管区炎细胞浸润，心、脑、肺、脾、肾组织学未见明显异常.LFF对照组病理改变与模型组类似.而

7、HDL治疗组小鼠肝细胞仅见肝细胞混浊肿胀等变性和轻微坏死（图1）.A:模型组;B:LFF对照组;C:HDL治疗.　　2.2HDL对肝衰竭小鼠肝细胞因子的影响　　模型组肝组织TNFα和IL6mRNA表达水平增高，LFF对照组与模型组无差异，HDL治疗组TNFα和IL6mRNA表达水平接近正常小鼠（图2）.　　3讨论　　内毒素含脂质A，脂蛋白是体内脂质运载的工具，因此，脂蛋白可以结合内毒素，是天然存在的细胞外LPS清除剂.本研究显示HDL能显著降低内毒素所致肝功能衰竭小鼠的死亡率.模型组小鼠肝脏发生广泛变性坏死，肾、脾、心、脑组织未见类似改变，与文献报道

8、用半乳糖胺敏化内毒素选择性诱导小鼠肝功能衰竭相一致［3］，LFF对照组小鼠肝脏组