沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探

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1、沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探【摘要】目的：探讨精液沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)感染与精子凋亡的关系，为研究男性不育提供新思路。方法：沙眼衣原体的检测用免疫层析法，采用瑞－姬染色精子，观察精子形态变化；用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧核苷酸原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡精子。结果：精液CT阳性组精子凋亡率（33.03±14.98）％，正常对照组精子凋亡率为（9.68±2.78）％，组间差异显著（P＜0.01）。结论：精液CT感染导致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。【关键词】精子

2、；衣原体,沙眼；细胞凋亡；不育，男性　　［Abstract］Objective:ToinvestigatedtherelationshipofChlamydiatrachomatis(CT)infectionapoptosisthatmightrelatealesterility.Method:Immunochromatographymethodydiatrachomatis;Conventionalcellmorphologystaining(sastaining),andterminaldeoxynucleotidyltransferaseenz

3、yme(TdT)mediateddeoxynucleotidylinsituandlabeling(TUNEL)apoptosisratesalfertilitygrouprespectively;Thereaticallydifferencebetencausedincreaseofspermapoptoticrates.Conclusions:CTinfectionmightbeoneofthemostimportantcausesformaleinfertility.　　［Keyatozoa;chlamydiatrachomatis;apopt

4、osis;infertility,male　　男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在症状或非症状男性生殖道感染中，起关键作用的两种生物体是解脲支原体(mycoplasmaurealytium;MU)和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis;CT)。近年来，关于MU感染与男性不育的关系已有大量的报道，但CT感染对精子及男性不育的影响报道不多[1～3]，CT感染引起男性不育的机制仍不清楚。据a公司提供，percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供，TritonX100由北京拜尔迪生物公司提供。　　1.3研究方法　　所有研究对象

5、均禁欲3～5d，手淫法收集全程精液于无菌玻璃容器中，置于35℃恒温恒湿箱中液化。取液化后的精液2ml加入底部有2ml45%Percoll液的离心管中，2000r/min离心10min，精液细胞主要沉积于精浆和45％Percoll液之间，于精浆与45％Percoll液之间用移液器取50μl×5次精液沉淀入另一组离心管中，加入2ml生理盐水，充分混匀；1500r/min离心10min弃上清液，加入生理盐水2ml；充分混匀后，1500r/min离心10min，弃上清液，加入生理盐水2ml；充分混匀后，1500r/min，离心10min弃上清液，加入3ml生

6、理盐水，充分混匀，配成一定浓度的细胞悬液。取制备好的精液细胞悬液50μl分别滴加在普通洁净的玻片（瑞姬染色用）和多聚赖氨酸防脱玻片（TUNEL时用）上，用采血针推平，弃去多余的细胞悬液，平放、自然凉干。　　1.4CT检测　　取液化后的精液1～2ml，1500r/min离心10min，取沉淀，按照试剂盒说明书进行操作。　　1.5常规形态学染色　　取制备好的普通玻片精液细胞样本，浸入瑞－姬染液中1min，倒入等量pH6.9的PBS缓冲液，再染10min，自来水冲洗，自然凉干后用光学树脂封片，置油镜下检查并拍照。　　1.6TdT介导的TUNEL法检测凋亡精

7、子　　取已制备好的多聚赖氨酸防脱玻片精液细胞样本浸入固定液，室温15～25℃固定15min～1h；-20℃的乙醇中放置2h；PBS漂洗3次，每次5min；浸入封闭液，室温15～25℃封闭10min；PBS漂洗3次，每次5min；浸入通透液中，冰上（2～8℃）促渗2min。PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干；每个样本滴加50μlTdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min；PBS漂洗3次，样本周围用吸水纸吸干；滴加50μlStreptavidinHRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min；PBS漂洗3次；滴加50μlDAB工作液，

8、室温显色反应10min；PBS漂洗3次，光学显微镜下检测及拍照。　　2.2TdT介导的TUNEL法检查凋亡精