塞来昔布对糖尿病大鼠视网膜凋亡抑制蛋白bcl2表达的影响

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1、塞来昔布对糖尿病大鼠视网膜凋亡抑制蛋白Bcl2表达的影响【摘要】目的：探讨塞来昔布对糖尿病(diabetesmellitus，DM)大鼠凋亡抑制蛋白Bcl2表达的影响。方法：将40只大鼠模型,随机分成DM组(n=20)和塞来昔布灌胃(celecoxibgroup，Cel)组(n=20)。另10只正常大鼠为正常对照组(contrastgroup,Con)。3mo后处死全部大鼠,制备大鼠视网膜石蜡切片,应用免疫组化法及HPIAS1000型高清晰度彩色病理图文分析系统观测大鼠视网膜Bcl2的表达。结果：Con组Bcl2反应阳性弱,表达量低;DM组Bcl2反应呈强阳性,表达增高(P<

2、;0.01);Cel组Bcl2反应阳性减弱,表达降低(P<0.01)。结论：Cel能够减少STZ诱导的DM大鼠视网膜凋亡抑制Bcl2蛋白表达。【关键词】糖尿病视网膜病变;凋亡抑制蛋白Bcl2;塞来昔布　　Correspondenceto:ZhanYuZhou.DepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266000,ShandongProvince,China.zhouzhanyu1125163.　　Abstract　　METHODS:Forty)最

3、常见和严重的眼部并发症,已成为目前世界上主要的致盲眼病之一,早期预防和治疗DR是当前眼科领域攻关的重要课题。视网膜新生血管的出现是DR最早出现的特异性改变，视网膜新生血管通常由视网膜毛细血管周细胞凋亡抑制所致。已有充分研究表明，在DM大鼠视网膜中COX2表达含量常显著增高[1]。实验证明，塞来昔布(celecoxib，Cel)作为新型的特异性COX2抑制剂,通过抑制COX2的活性抑制视网膜VEGFmRNA的表达,引起视网膜细胞合成VEGF蛋白减少[2]。血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞(endothelialcell,EC)的存活因子,它阻止了缺血诱导的细胞凋亡并且能诱导EC表达

4、凋亡抑制蛋白Bcl2，从而参与毛细血管的凋亡过程DR病理变化,并在视网膜新生血管的发生发展过程中起着重要作用。利用选择性的COX2抑制剂可使VEGF和bFGF等多种促血管生成因子的表达降低，下调凋亡抑制蛋白Bcl2表达从而阻断这些模型中的新生血管生成。我们探讨选择性COX2抑制剂Cel对链脲佐菌素(STZ)诱导的早期DM大鼠视网膜中Bcl2表达情况。应用免疫组化法及彩色病理图文分析系统观测在不同处理因素下DM大鼠视网膜Bcl2的表达,以探讨Cel对DM大鼠视网膜凋亡蛋白Bcl2表达的影响。　　1材料和方法　　1.1材料　　健康成年无眼疾的annheim公司)55mg/kg。另

5、10只大鼠分为正常对照组(contrastgroup,Con),每只ip等体积枸橼酸盐溶液。注射STZ24～48h检测尿糖(+++)以上、72h后取尾血测血糖≥16.7mmol/L者确定为DM大鼠。模型建立后每周监测1次定性尿糖、体质量、24h尿量和饮水量,每月检测1次血糖。DM大鼠随机分为DM组和Cel灌胃组，每组20只。DM模型建立2d后,Cel灌胃组大鼠经口灌胃Cel50mg/kg,2次/d,DM组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠单笼喂养,自由进食、饮水。饲养3mo。除去死亡及血糖恢复正常大鼠,最终每组15只入组。图1Bcl2凋亡抑制蛋白的表达A：Con组;B：DM组;C：Cel组。　　

6、1.2方法　　喂养3mo末,以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,轻摘左眼球,放入预先配置的40g/L中性甲醛溶液中。将各组大鼠的右侧眼球,也固定于40g/L多聚甲醛液中(4℃,12h)。于锯齿缘后0.15mm处剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体,余下的眼杯进行全层石蜡包埋,制作5～7μm切片。以微波处理10min(95℃);30mL/LH2O2700mL/L甲醇室温处理30min;30mL/L正常小牛血清室温孵育30min;抗Bcl2抗体即一抗(SantaCruz,USA,为多克隆抗体,浓度各为1∶150),湿盒内4℃孵育20h;生物素标记的羊抗兔血清即二抗(VectorLaboratory,US

7、A)1∶200,湿盒内37℃孵育1h;卵白素2生物素即ABC复合物(VectorLaboratory,USA)湿盒内于37℃孵育1h;DAB呈色,显微镜下监视反应,约10min,以蒸馏水停止反应。苏木素复染梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照:以正常小牛血清代替一抗,其余步骤同上。随机选取Con和Cel及DM各组视网膜切片3张,每张切片随机取5个视野,应用HPIAS1000型图像分析系统测定Bc