脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

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1、脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性

2、。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学Abstract:ObjectiveIsolationandcultivationofmesenchymalstemcells(MSCs)inhumanumbilicalcordinvitro,anddeterminetheirbiologicalproperties.MethodsThemononuclearcellshumanumbilicalcordbloodinsterilecondit

3、ion,andculturedinDMEMmediumcontaining10%fetalbovineserum.Aftertheadherentmononuclearcellsicroscope,thenthecellgromunocytochemistryandfloetrymethods.ResultsMSCsobtainedbyPercoll(1.073g/mL)ilarinsize,spindle-shapedorstar-shapedfibroblasts-likedcells.Cellgroetrya

4、nalysisshoanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcellsanumbilicalcordblood;mesenchymalstemcells;cellcycle;immunocytochemistry　　间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞。寻找丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilicalcordblood,UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一

5、起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs作为间充质干细胞的可行性。　　1材料与方法　　1.1UCB-M

6、SCs的分离与培养　　9份脐血标本均于辽宁医学院附属第一医院，均获得产妇同意。以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液(Fercoll，1.073g/mL,美国Sigma公司)，650g离心15min。抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液(DMEM/F12，10%胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mmol/LL-谷氨酰胺)重悬，接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养。第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60%～80%融合时，0.2

7、5%胰酶(含0.02%EDTA)常规消化传代。　　1.2UCB-MSCs细胞表面抗原分析　　分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。含2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞，室温下分别与CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE及CD45-PE单克隆抗体避光孵育15min。PBS缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。加入含1%多聚甲醛的PBS缓冲液0.3mL，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪分析细胞表面抗原。　　1.3UCB-MSCs体外增殖能力检测　　分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消

8、化，接种24孔板，每孔1×104个细胞/mL。胰酶消化并计数，每天计数3孔，绘制细胞的生长曲线。　　1.4细胞活性检测　　分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×104个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板，在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养2天。向每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS，pH=7.4配制)10μL。继续孵育4