脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定论文

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1、脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定论文【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定.

2、freelesenchymalstemcells(MSCs)inhumanumbilicalcordinvitro,anddeterminetheirbiologicalproperties.MethodsThemononuclearcellshumanumbilicalcordbloodinsterilecondition,andculturedinDMEMmediumcontaining10%fetalbovineserum.Aftertheadherentmononuclearcellsicroscope,thenthecellgromunocytoche

3、mistryandfloetrymethods.ResultsMSCsobtainedbyPercoll(1.073g/mL)ilarinsize,spindle-shapedorstar-shapedfibroblasts-likedcells.Cellgroetryanalysisshoanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcellsanumbilicalcordblood;mesenchymalstemcells;cellcycle;immunocytochemistry间充质干细胞(mesenchymalstemcel

4、ls，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点1。脐血(umbilicalcordblood,UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值2,3

5、。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs作为间充质干细胞来源的可行性。1材料与方法1.1UCB-MSCs的分离与培养9份脐血标本均来源于辽宁医学院附属第一医院，均获得产妇同意。以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液(Fercoll，1.073g/mL,美国Sigma公司)，650g离心15min。抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液(DMEM/F12，10%胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mmol/LL-谷氨酰胺)重悬，接种至100mm培养皿

6、，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养。第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60%～80%融合时，0.25%胰酶(含0.02%EDTA)常规消化传代。1.2UCB-MSCs细胞表面抗原分析分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。含2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞，室温下分别与CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE及CD45-PE单克隆抗体避光孵育15min。PBS缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。加入含1%多聚甲醛的PBS缓冲液0.3mL，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪分析细胞表面抗原。1.3UCB-

7、MSCs体外增殖能力检测分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，接种24孔板，每孔1×104个细胞/mL。胰酶消化并计数，每天计数3孔，绘制细胞的生长曲线。1.4细胞活性检测分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×104个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板，在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养2天。向每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS，pH=7.4配制)10μL。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。1

8、.5统计学处理应用SPS