苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子β1的影响

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1、苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子β1的影响　　〔摘要〕　目的：研究苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，阐明其抗肝纤维化的作用机制。方法：用甲基噻唑基四唑MTT(methylthiazolyltetrazolium)比色法、HE染色及免疫细胞化学技术分别检测小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)增殖、形态学及TGF-β1的表达。结果：苦参素能明显抑制成纤维细胞增殖及TGF-β1的表达，并呈剂量依赖性。结论：苦参素可通过抑制成纤维细胞增殖及TGF-β1的

2、表达而起到抗肝纤维化作用。　　AffectofkorphologyandexpressionofTGF-β1　　〔ABSTRACT〕　AIM:Tostudytheaffectofkorphologyandexpressionoftransforminggroechanisminfibrosis.　METHODS:Theproliferation,morphologyandexpressionofTGF-β1offibroblasteasuredbyMTTbioassay,HEdyeingandim

3、munocytochemistry.　RESULTS:Thekanner.　CONCLUSION:ThekinggroL:200mg，批号980215，上海第一生化药业公司)，RPMI1640培养基、小牛血清、胰酶、甲基噻唑基四唑(MTT，华舜生物试剂公司)，二甲基亚砜(DMSO)，苏木精染液，伊红染液；TGF-β1免疫组织化学染色试剂盒，DAB显色试剂盒。B5060EX二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司产品)，37XAZ倒置生物显微镜(上海光学仪器厂)，Olympus光学显微镜，DG-302

4、2型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，YS-875A净化工作台。　　方法　　1　MTT法检测不同浓度的苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响　用0.25%胰蛋白酶消化单层培养NIH3T3细胞，用含10%的小牛血清RPMI1640培养液稀释为单个细胞悬液(5×107个·L-1)，接种于96孔培养板，每孔100μL，同时每孔加入经培养液倍比稀释的苦参素100μL，至苦参素终浓度分别为31.3，62.5，125，250，500，1000mg·L-1，每种浓度设3个复孔；并设对照孔3个，不加苦参素，而加入等

5、量的培养液；另设空白对照孔3个，不加细胞，其他条件与前相同。同时，在相同条件下用同样方法再接种另2块96孔培养板。将培养板移入CO2孵箱中，培养48h后，每孔加入MTT溶液(5g·L-1，PBS)20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，选择490nm波长，以空白对照孔调零，检测各孔光吸收值，将所得结果进行统计学分析。　　2　苦参素对成纤维细胞形态学及TGF-β1的影响　制细胞爬片：将生长良好的NI

6、H3T3细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×108个·L-1，接种于含盖玻片的2块培养皿中，其中一块加入苦参素使终浓度为500mg·L-1，另一块加入等量的培养液，放入CO2孵箱培养2～3d，待细胞基本长成单层，取出盖玻片，95%乙醇固定。HE染色；TGF-β1免疫细胞化学染色：将经苦参素处理和未处理的细胞爬片各一块，滴加适当稀释的一抗(小鼠TGF-β1单抗)，37℃孵育1.5h，0.01mol·L-1的PBS洗2min，2次；滴加山羊抗小鼠IgG，37℃孵育15min，0.

7、01mol·L-1的PBS洗2min，2次；滴加试剂APA-兔抗山羊IgG,37℃，20min,0.01mol·L-1PBS洗5min，4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察，照相保留结果。　　3　统计学方法　t检验，P＜0.05为有显著意义。　　结果　　1　苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响　不同浓度的苦参素作用于NIH3T3细胞48h后，平均每孔

8、的吸光度如表1所示，当苦参素浓度达到62.5mg·L-1时，NIH3T3细胞增殖活性受到明显抑制(P＜0.05)，并呈剂量依赖性。表1　MTT法检测苦参素对NIH3T3细胞增殖　　的影响(n=9,±s)组别浓度/mg·L-1吸收度(OD)对照　　　　　00.447±0.013131.30.431±0.020a262.50.338±0.014b31250.272±0.016c42500.221±0.019ce55000.199±0.021c610000.179±0.020ce　　各组