基因芯片技术检测利福平药物诱导 h37rv株基因突变的应用研究

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1、基因芯片技术检测利福平药物诱导H37Rv株基因突变的应用研究【摘要】目的用利福平、异烟肼药物作用H37Rv株，诱导基因突变，用基因芯片技术检测耐药菌株突变基因位点。方法H37Rv菌株用不同浓度的利福平和异烟肼加入培养液中观察菌株的耐药生长情况，耐药菌株用PCR扩增产物杂交，基因芯片检测药物作用部位是否有突变，检测突变基因位点。结果利福平药物诱导H37Rv耐药，用基因芯片技术检测利福平耐药菌株，rpoB基因531位发生突变，TCG转变为TTG，直接测序发现在相同位点发生突变。耐异烟肼耐药菌株katG基因315位发生突变，AGC转变为

2、ACC。同时加入两种药物的耐药株用基因芯片检测分别在rpoB基因531位，katG基因315位发生突变。结论结核分枝杆菌产生耐药的机理与药物作用基因位点突变有关。基因芯片检测技术耐药菌株基因突变，不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，快速、高效、设备简单，并能同时检测分析成千上万个基因有关突变位点。【关键词】H37Rv株；药物诱导耐药；DNA芯片；突变基因我国是世界上结核病发病率最高的22个国家之一，肺结核患者约有600万人，每年约有25万人死亡。世界卫生组织报警：肺结核日夺全球千人性命，在西太平洋地区每日有近1000人死于肺结核

3、，将削弱地区的经济增长，肺结核大部分患者年龄在15岁至54岁之间，是社会的主要劳动力。如果作为家庭经济支柱，经济有重要影响，在孟加拉国每2min就有1人感染肺结核，每10min就有1人死于结核病。结核病严重危害人类健康及经济的发展。结核病流行显示高患病率、高耐药率、低速降率等特点[1]，特别是抗结核药物的广泛应用及不合理的服药，结核杆菌产生高耐药，临床检测困难，耐药菌株存在作为传染源，对流行病的控制带来严重威胁。快速检测那部分耐药菌株，可为临床诊断治疗提供可靠的依据。为了消除传染源，控制结核病的流行，我们用利福平等药物作用于结核菌

4、，用基因芯片技术检测耐药菌株的基因变化，有快速高效的应用效果，现报道如下。1材料和方法1.1材料和仪器1.1.1全自动血培养仪EspclturesystemⅡ。1.1.2结核菌培养液Espmyco培养瓶，12.5mL/瓶，美国TREKDiagnosticsystemsInc生产。1.1.3生物安全柜Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰净化设备有限公司。1.1.4煮沸箱。1.1.5Lightcycler荧光PCR仪。1.1.6Generalscanning芯片信息系统Scannarray3000扫描仪。1.1.7基因芯片由中科院上海信

5、息系统和微技术研究所，宁波瑞芯生物科技有限公司生产。1.1.8引物正向CAGGACGTGGAGGCGATC18bp；反向CGCTCACGTGACAGACCG18bp；由上海生工工程技术服务有限公司合成。1.1.9H37Rv菌株购自中国药品生物制品检定所1.1.10利福平﹑异烟肼医院购买。1.2方法用利福平﹑异烟肼药物诱导作用H37Rv菌株。1.2.1H37Rv菌株在无菌生物柜中打开，用无菌生理盐水稀释，抽取0.5mL接种。Espmyco培养基中置EspculturesystemⅡ培养仪培养，3周后见细菌生长，继续培养1周后取培养液

6、0.5mL分别接种于Espmyco培养基中，置培养仪培养，培养2周后见各瓶有细菌生长。1.2.2用利福平加入培养悬液中诱导作用于细菌。利福平0.15g/粒，用无菌生理盐水10mL溶解呈150mg/10mL，抽取1mL=15mg/mL利福平加9mL生理盐水，即呈1.5mg/mL，即1500g/mL利福平。1.2.3取1500g/mL利福平2mL加入培养液中，浓度呈240g/mL利福平。取1500g/mL利福平0.4mL加入培养液中，浓度呈48g/mL利福平。取1500g/mL利福平0.4mL加入培养液中，浓度呈4.8g/mL利福平。

7、依据g2+2.5mmol/L2L，10pmmol/mL，引物1、2各0.75L。加水12.5L。聚合酶链反应程序：首先将标本预变性94℃4min，再以94℃30s，60℃30s，70℃30s循环35次。再后72℃延伸4min，置2~8℃保存。KatG反应体系：50L。Buffer5L；2mmol/LMgCl4L；dntp5L；引物120mol/L1L；引物220mol/L1L；Tap聚合酶5g/l0.4L；模板5L；H2O28.6L。反应程序：首先94℃3min预变性，然后以94℃1min，64℃1min，72℃1min，35个循

8、环，再后以72℃5min延伸，置2~8℃保存。1.2.7聚合酶链扩增产物由中科院上海信息系统和微技术研究所宁波瑞芯生物制品有限公司用基因芯片技术进行基因测序及基因突变分析。H37Rv对照样本及耐药菌株的扩增产物，用基因芯片序列测定。该芯片包括：51