结核分枝杆菌耐利福平株rpob基因突变的研究

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1、结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变的研究廖小琴刘梅(通讯作者)王建华张泓陈玲(通讯作者)(遵义医学院附属医院呼吸二科呼吸医学研究室贵州遵义563003)【摘要】目的了解遵义地区结核分枝杆菌耐利福平临床分离株rpoB基因突变特点。方法采用比例法对肺结核患者痰标木分离的127株结核分枝杆菌进行药物敏感性试验，并对结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因括耐药决定IX81个碱基在内的412bp片段进行PCR扩增及序列测定。结果127株结核分枝杆菌临床分离株中49株对利福平耐药，78株对利福平敏感。49株耐利福平临床分离株中，31株rpoB基因存在

2、突变(63.3%)，突变位点为531、526和516等；511位点CTG→CAG(Leu→Pro)为新的突变位点；4株双位点联合突变，其中2例为新的联合突变：GAC516GGC,ATC572CTC和CTG511CAG,CAC526AAC。结论结核分枝杆菌耐利福平与rpoB基因突变相关，且存在地区差异。【关键词】结核分枝杆菌rpoB利福平耐药突变近年来，由于耐药结核病的广泛流行等原因，结核病呈现死灰复燃趋势。利福平(rifampin，RFP)是目前抗结核一线药物中主要药物。RFP与结核分枝杆菌(mycobacteriu

3、mtuberculosis,MTB)RNA聚合酶β亚基结合，抑制转录而发挥杀菌作用。RNA聚合酶β亚基由rpoB基因编码。MTB对RFP耐药主要与rpoB基因的突变有关。目前己发现的耐RFP临床分离株中rpoB基因突变位点超过70个，约96%的RFP突变分布在rpoB基因的利福平耐药决定区(rifampinresistancedetermingregion,RRDR)的81个碱基内，以531、526及516位点突变最常见［1］。木研究旨在了解木地区耐利福平MTBrpoB基因突变特点，为耐药结核病的快速检测奠定基础。1

4、材料与方法1.1MTB临床分离株的来源、培养及药物敏感试验肺结核患者痰标木来自贵州省遵义医学院附属医院2009年6月至2012年7月期间门诊及住院病人，分离出MTB共127株。结核分枝杆菌H37RV标准株由贵州省疾病预防控制中心结核病防治所惠赠。MTB培养及药物敏感试验(比例法)按《结核病诊断实验室检验规程》进行。1.2MTB基因组DNA的提取及PCR扩增1.2.1MTB火活及破壁处理:用接种环刮取适量新鲜菌落，置于含少量生理盐水的无菌离心管中,80°C火活30min；12000r/min离心5min,弃上清，各加入400ull&tim

5、es;TE溶液，吹打混匀制成菌悬液，加入50ul溶菌酶溶液，混匀,37°C孵育过夜。1.2.2DNA提取：采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA,-2(TC保存备用。使用前用火菌超纯水将DNA原液稀释为10ng/ul的工作浓度。1.2.3rpoB基因的扩增：rpoB引物由英潍捷基(上海)贸易奋限公司合成，引物上游5′-TCGACCACTTCGGCAACCGC-3′,下游5′-TTGACCCGCGCGTACACCGA-3′(412bp)。PCR总体积为25ul,包括:10&time

6、s;HighFidelitybuffer2.5ul、lOmmol/LdNTPMix0.5uL20mmol/L的上、下游引物各0.5ul、ddH2O19.75ul、HighFidelityHotStartPolDNA聚合酶0.25uk10%/111的1/1了80似模板11

7、

8、。反应条件95°C2min，95°C20s?62°C30s,68°C40sz30个循环；68°C40soPCR产物各取lul，经2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.3rpoB基因测序与分析将PCR产物送至上海立菲技术有限公司(原上海英骏公司)进行DNA测序，引物采

9、用rpoB-F。用NCBIBLAST在线将所测得的序列与H37Rv菌株的rpoB标准序列(GenBank：NC_000962)进行比对，并分析结果。2结果2.1MTB利福平药物敏感试验127株MTB中49株对利福平耐药，78株对利福平敏感，耐药率38.6%。2.2PCR扩增产物与0的片段大小一致49例MTB菌株rpoB基因的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，于412bp大小左右出现特异性条带，部分PCR产物电泳图谱见图1。2.3rpoB基因测序49株耐利福平MTB中，31株存在突变，突变率63.3%，其中单位点突变率55.1%(27/

10、49),联合突变率8.1%(4/49);531、526及516位点的突变率分别为38.3%(19/49)、12.9%(4/49)和16.1%(5/49),531位和526位两者之和为46.9%,其中以TCG