急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期t细胞免疫重建的研究

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1、急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建的研究：吴秀丽　李扬秋朱康儿,杨力建陈少华,卢育洪陈洁,刘启发【摘要】目的:监测急性髓性白血病(AML)患者接受异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后外周血中的T细胞受体重排删除环(TRECs)水平,了解移植后早期的T细胞免疫重建情况。方法:AML患者15例分别在alloHSCT前以及alloHSCT后每隔2周收集外周血,采用实时定量PCR法检测外周血单个核细胞(PBMNCs)中的TRECs水平;7例年龄相近的正常人外周血样本作为对照。流式检测CD45R

2、A+细胞亚群和CD45RO+细胞亚群的阳性率。结果:alloHSCT组移植前的TRECs平均拷贝数为(1.42±1.51)拷贝/1000PBMNCs,明显低于正常组的(3.03±0.45)拷贝/1000PBMNCs水平;移植后第12周的TRECs平均拷贝数为(1.67±1.93)拷贝/1000PBMNCs,与正常相比仍然较低。移植后8周内以CD45RO+/CD4+细胞的扩增为主,而外周血TRECs水平在alloHSCT后4周左右出现短暂地升高趋势,随后又下降,至alloHSCT8周后才开始稳步上升。有急性移植物抗宿

3、主病(aGVHD)病史的移植患者的外周血TRECs水平显著降低,明显低于无aGVHD病史移植患者的外周血TRECs水平。3例移植后早期复发的患者的外周血TRECs水平降至基线水平或检测不到。结论:不同个体T细胞免疫重建时间存在差异;AML患者在alloHSCT后早期(90d内)的胸腺输出功能仍处于恢复阶段,移植后4周内的免疫重建仍以于供者细胞的外周扩增为主;外周血TRECs水平可能与AML患者alloHSCT后病情的发展、转归有关。【关键词】造血干细胞移植,异基因;T细胞受体重排删除环;免疫重建异基因造血干细胞移植(

4、allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,alloHSCT)是目前治疗急性髓性白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)等恶性血液病的有效方法之一,已广泛应用于临床。造血干细胞移植后造血功能的全面重建主要包括两个方面,即造血细胞数量和功能的恢复,后者主要是指免疫功能重建。临床上往往将中性粒细胞和血小板的恢复作为造血恢复的指标,容易忽视免疫功能的恢复。免疫功能重建现在被认为是评价移植疗效的重要因素之一,alloHSCT后重建T细胞特异性免疫功能

5、,需要于胸腺依赖途径所产生的初始T细胞,即经胸腺发育而输出的nave细胞,而目前能够作为naveT细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环(TcellreceptorexcisionDNAcircles,TRECs)[1-3]。为了解AML患者接受alloHSCT后早期的T细胞免疫重建情况,我们对其胸腺近期输出功能(外周血TRECs水平)进行了监测,并对外周血CD45RA+/CD4+、CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+细胞亚群进行了流式细胞术分析。　　1对象和方法　　1.1对象接受alloHSCT治

6、疗的AML患者15(男13,女2)例,年龄18～56(中位年龄35.7)岁,其中M25例,M32例,M45例,M53例;供者为HLA位点完全相合同胞或无关供者;采用联合氟达拉宾的减量清髓预处理方案;移植后受者全部植活(中性粒细胞连续3d≥0.5×109/L为粒细胞植活,血小板连续7d≥20×109/L为血小板植活),所有受者移植后均为完全供受者嵌合体;所有患者alloHSCT后临床上未采用改变细胞亚群数量的特殊治疗方案,并均告知同意及医院伦理委员会同意。分别于移植前、移植后每间隔2周收集患者外周血样本;同时收集7例与移

7、植组年龄相近的正常人(均为男性)外周血样本作为对照,年龄17～48(中位年龄31.6)岁。　　1.2方法　　1.2.1流式细胞术检测CD45分子表达和DNA提取按常规方法收集各样本的外周血单个核细胞(PBMNCs),计数后一部分细胞用于免疫荧光标记(鼠抗人CD4+、CD8+、CD45RA、CD45ROmAb,Fermentas),利用流式细胞术进行CD45RA+/CD4+、CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+细胞亚群阳性率的检测;剩余细胞提取DNA(QIAprepSpinMiniprepKit,QIAgen

8、),并用紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度。　　1.2.2引物设计从T细胞受体(TCR)δ基因组序列(ACCESSIONAE000661)中于δRec基因片段的下游设计一下游引物(T1)和在ψJα的上游设计一上游引物(T2)[2],引物的方向恰好与一般的PCR引物相反(所检测的是δRec和ψJα的两个基因片段删除后