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时间:2018-05-05
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1、含bFGF的壳聚糖-胶原复合支架对牙周膜细胞生长和增殖的影响【摘要】【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞(HPDLC)生长和增殖的影响。【方法】MTT法观察含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响,利用流式细胞仪(FCM)检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响,并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内,
2、通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液,而后两组间无统计学意义;含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期;HPDLC在含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架。【结论】含bFGF因子壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架可以促进体外培养的
3、HPDLC生长和增殖。【关键词】碱性成纤维细胞生长因子;壳聚糖;Ⅰ型胶原;复合支架;牙周膜细胞牙周组织缺损的修复主要针对牙周韧带、牙骨质和牙槽骨,目前利用组织工程材料修复牙周组织缺损的研究很多[1-3]。组织工程的三大基本要素是种子细胞、可降解的支架材料与细胞生长调节因子。当前组织工程化组织的构建方式有3种:①支架材料+种子细胞;②支架材料+生长因子;③支架材料+种子细胞+生长因子。本课题组在先期研究壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架材料的基础上[4],将人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcell
4、s,HPDLC)接种于含碱性成纤维细胞生长因子(rebinanthumanbasicfibroblastgroa,脱乙酰度85%),Ⅰ型胶原(广州创尔生物技术有限公司),DMEM(Sigma),胎牛血清(FBS,Gibco),胰蛋白酶(Trypsin,Ameresco),波形丝蛋白(Vimentin,Sigma),角蛋白(Keratin,博士德),SABC-FITC免疫组化试剂盒(博士德),SANYOMDF2192AT型超低温保存箱(日本),UnicryoMC2L-60℃冷冻干燥机(德国),HITACHIS-300
5、0N扫描电镜(日本),激光共聚焦显微镜(德国蔡司)。1.2壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架的制备室温下将壳聚糖溶于0.2mol/L乙酸并搅拌均匀,配成20g/L的壳聚糖溶液,Ⅰ型胶原以同等浓度乙酸配成4.6g/L的胶原溶液,0.22μm滤器过滤除菌,壳聚糖、Ⅰ型胶原按体积比1∶1混合,一组加入bFGF(10ng/mL)为A组,另一组为B组,加入同等量的DMEM,搅拌均匀后离心除渣脱泡。将溶液倾入预冷的24孔板中在-20℃下冻存24h,后移入冻干机冻干24h,密封4℃保存。1.3壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架扫描电镜和孔径大小、孔
6、隙率的测定取以上支架材料,浸入液氮后折断,分别对其表面和内部结构喷铂金处理,扫描电子显微镜下加速电压20kV,放大不同倍数观察,并在材料内部选取5个高倍视野(100倍),每视野测量10个孔径值,计算材料的平均孔径。采用液体位移法测定支架的孔隙率[5]。将支架样本切成5mm×5mm大小,置入体积为V1的无水乙醇中,5min后负压吸引脱气,使乙醇充分进入多孔支架的孔隙中,直至再无气泡逸出,此时乙醇体积(浸没支架)计为V2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出,剩余乙醇体积计为V3。支架的孔隙率如下计算:e=(V1-V3)/(V
7、2-V3),每个样本测5次,取其均值。1.4HPDLC的体外培养和鉴定参照Inoue培养方法[6],取因正畸需要拔除的新鲜第一前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织,剪成1mm3碎块,以含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液,在饱和湿度、5%CO2、37℃条件下细胞培养箱中孵育,细胞快长满培养瓶底时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代,取第4或5代细胞用于实验。消化第5代HPDLCs,接种于六孔板中的盖玻片上,培养3d后用40g/L多聚甲醛固定20min,0.01mol/LPBS洗涤3次,正常山羊血清室温封闭20min,滴加
8、一抗(小鼠抗人波形丝蛋白(1∶500),小鼠抗人角蛋白(1∶200)于4℃过夜,0.01mol/LPBS洗涤3次,加抗小鼠IgG-FITC荧光二抗,37℃避光孵育30min,0.01mol/LPBS洗涤3次,加Hoechest33342室温孵育20min标记细胞核,0.01mol/LPBS洗涤3次后荧光封片剂封片,荧光显微镜下观察。1.5MTT法和流式细胞仪
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