含bfgf的壳聚糖－胶原复合支架对牙周膜细胞生长

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1、含bFGF的壳聚糖－胶原复合支架对牙周膜细胞生长【摘要】【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞（HPDLC）生长和增殖的影响。【方法】MTT法观察含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响，利用流式细胞仪（FCM）检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响，并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架内，

2、通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液，而后两组间无统计学意义；含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期；HPDLC在含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架。【结论】含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架可以促

3、进体外培养的HPDLC生长和增殖。【关键词】碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖；Ⅰ型胶原；复合支架；牙周膜细胞牙周组织缺损的修复主要针对牙周韧带、牙骨质和牙槽骨,目前利用组织工程材料修复牙周组织缺损的研究很多[1-3]。组织工程的三大基本要素是种子细胞、可降解的支架材料与细胞生长调节因子。当前组织工程化组织的构建方式有3种:①支架材料+种子细胞;②支架材料+生长因子;③支架材料+种子细胞+生长因子。本课题组在先期研究壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架材料的基础上[4],将人牙周膜细胞(humanperiodontal

4、ligamentcells,HPDLC)接种于含碱性成纤维细胞生长因子（rebinanthumanbasicfibroblastgroa，脱乙酰度85%），Ⅰ型胶原(广州创尔生物技术有限公司),DMEM(Sigma)，胎牛血清(FBS,Gibco)，胰蛋白酶（Trypsin,Ameresco），波形丝蛋白（Vimentin,Sigma），角蛋白（Keratin,博士德），SABC-FITC免疫组化试剂盒（博士德），SANYOMDF2192AT型超低温保存箱(日本)，UnicryoMC2L-60℃冷冻干燥

5、机(德国)，HITACHIS-3000N扫描电镜（日本），激光共聚焦显微镜（德国蔡司）。1.2壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架的制备室温下将壳聚糖溶于0.2mol/L乙酸并搅拌均匀，配成20g/L的壳聚糖溶液，Ⅰ型胶原以同等浓度乙酸配成4.6g/L的胶原溶液，0.22μm滤器过滤除菌，壳聚糖、Ⅰ型胶原按体积比1∶1混合，一组加入bFGF（10ng/mL）为A组，另一组为B组，加入同等量的DMEM，搅拌均匀后离心除渣脱泡。将溶液倾入预冷的24孔板中在－20℃下冻存24h，后移入冻干机冻干24h，密封4℃保存。1.

6、3壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架扫描电镜和孔径大小、孔隙率的测定取以上支架材料，浸入液氮后折断，分别对其表面和内部结构喷铂金处理，扫描电子显微镜下加速电压20kV,放大不同倍数观察，并在材料内部选取5个高倍视野（100倍），每视野测量10个孔径值，计算材料的平均孔径。采用液体位移法测定支架的孔隙率[5]。将支架样本切成5mm×5mm大小，置入体积为V1的无水乙醇中，5min后负压吸引脱气，使乙醇充分进入多孔支架的孔隙中，直至再无气泡逸出，此时乙醇体积(浸没支架)计为V2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出，剩余乙醇

7、体积计为V3。支架的孔隙率如下计算：e=(V1-V3)/(V2-V3)，每个样本测5次，取其均值。1.4HPDLC的体外培养和鉴定参照Inoue培养方法[6]，取因正畸需要拔除的新鲜第一前磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，剪成1mm3碎块，以含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液，在饱和湿度、5%CO2、37℃条件下细胞培养箱中孵育，细胞快长满培养瓶底时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代，取第4或5代细胞用于实验。消化第5代HPDLCs，接种于六孔板中的盖玻片上，培养3d后用40g/L多聚甲醛固定20min

8、，0.01mol/LPBS洗涤3次，正常山羊血清室温封闭20min，滴加一抗（小鼠抗人波形丝蛋白(1∶500)，小鼠抗人角蛋白（1∶200）于4℃过夜，0.01mol/LPBS洗涤3次，加抗小鼠IgG-FITC荧光二抗，37℃避光孵育30min，0.01mol/LPBS洗涤3次，加Hoechest33342室温孵育20min标记细胞核，0.01mol/LPBS洗涤3次后荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。1.5MTT法和流式细胞仪检测将复合支