bfgf对肝纱固化的去细胞血管支架再细胞化作用的研究

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1、5·论文·bFGF对肝素固化的去细胞血管支架再细胞化作用的研究刖吾冠状动脉粥样硬化疾病是世界范围内危害人类健康的主要疾病，病情严重的患者需要进行血管旁路移植手术，即通常所说的“冠脉搭桥"，就血管材料而言，术中所应用的移植材料一般取自自身，如大隐静脉、胃小弯动脉、胸廓内动脉、桡动脉等【l川，目前最为常用的移植材料是自身大隐静脉【5】，但一般搭桥手术的患者，大多需要3支或3支以上的移植血管，部分患者甚至需要再次手术，因此临床对血管移植物的需求很大，常存在“供不应求"的状况；虽然动脉材料的远期通畅率明显优于静脉材料，但在某些特殊情况下，如肢体疾病、动脉粥样硬化、

2、截肢等原因，患者的自身血管材料受到限制，且全动脉化搭桥术创伤较大，手术时间长，无法完全满足临床治疗的需要。因此，本课题旨在研究出一种外源性的，适合用于冠脉搭桥等术式的小口径血管。脱细胞血管材料是将天然血管经过特殊处理将实质细胞去除，保留相对完整的细胞外骨架结构，抗原性无或低、与受体细胞有极佳的相容性[61，以及含有促进细胞生长特殊生物信息的生物性细胞外基质[71，成为血管移植的理想材料【引。尤其是同种脱细胞血管支架材料，减少了种间的相互感染，更易于被内皮细胞黏附和以后的再塑，同时也不会降解为潜在的可能会对身体有害的物质，因此，脱细胞同种异体血管支架已经被认

3、为是除自体血管以外最有潜力的受损血管替代物【9】。研究证明，内皮细胞的完整对防止血管内血栓的形成具有重要作用，移植血管内覆内皮细胞可以有效的减少血栓的形成‘10n1。基于该事实，我们设想，如能在防止移植血管内血栓形成的前提下，快速的促进移植血管的内皮化，势必可以减轻移植血管内血栓形成，提高移植血管的通畅率。肝素的抗凝作用已被广泛认识，把肝素结合在人工材料(冠状动脉支架、CPB管道、IABP管道等)的表面，证实肝素可以在6局部缓慢持久地释放抗凝活性【12】。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast·growthfactor,bFGF)能调节血管

4、壁细胞(如：内皮细胞和平滑肌细胞)的生长和功能，与移植血管的内皮化密切相关，此外，该生长因子能结合肝素或硫酸肝烈13】，共同作用促进去细胞血管支架的再内皮化，完成去细胞血管支架的重塑。因此，本实验通过模拟冠状动脉旁路移植术建立兔异体颈动脉移植模型，对去细胞预载bFGF的兔颈动脉进行体内研究，然后通过生物化学方法、免疫化学检查和电镜等手段观察移植血管材料的内皮化程度，评价其作为冠状动脉旁路移植术重异体血管来源的可行性。材料与方法一、主要试剂和仪器(一)主要试剂(1)PBS缓冲液(0．Olmmoi／L，PH7．4)NaCl8．0克Na2HP041．44克KCL

5、0．2克Kid2P040．2克加双蒸水到950ml，调整PH值至7．4，最后加双蒸水到1000ml，高压蒸汽灭菌20min后备用。(2)Dnase酶和RNase酶(Genview公司)用PBS液分别稀释配成30u／ml和0．3mg／ml的浓度的溶液(3)TritonX-100(夏斯生物公司)用PBS液稀释配成O．5％的溶液，过滤除菌后备用(4)胰蛋白酶(上海生工)用PBS液稀释配成0．025％的溶液，过滤除菌后备用(5)乙二胺四乙酸(EDTA)(上海生工)用PBS液稀释配成0．02％的溶液，过滤除菌后备用(6)青霉素和链霉素(上海生工)705)d,鼠抗兔因

6、子单克隆抗体(Gib‘zo公司)、(二)主要仪器(1)水浴恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)(2)AG-245电子天平(MettlerTolledo公司)O)LKB—IlI型超薄切片机(瑞典)(4)普通光学显微镜(日本Nikon公司)(5)显微手术器械(上海医疗器械有限公司)(6)JSM-300电镜(日本电子公司)(7)9-0无创医用缝线(苏州医用缝合针厂)二、实验方法(一)兔颈动脉的采取及保存热缺血时间小于10min取兔(1．5~2．5kg)双儇IJ颈动脉，在其发自主动脉弓部位离断近心端，在第一个主分支处离断远心端，全长约4“啪。血管取出后立即置于等渗冰盐

7、水中保存，在冰盐水中轻柔修剪血管外周脂肪及多余的疏松结缔组织，用生理盐水冲洗干净血管腔内的血凝块。(二)去细胞处理1、脱细胞步骤修剪好的颈动脉置于0．5％TritonX-100的PBS液中，37'12孵育6h；80．025％Trypsin和0．02％EDTA(1：1)，3712孵育15rain；30ttg／mLDNA酶和0．3mg／mLRNA酶溶液(1：1)37℃孵育6h：整个过程均在水浴恒温振荡器中进行(振荡频率：100次／rain)，每个步骤完成后均用PBS液冲洗3次，所有步骤完成后再用PBS漂洗3次，每次约10min,再行各个项目检测或放置于4℃无菌

8、PBS液(含青霉素和链霉素各loou／mD中保存备用。2、固化肝素