多柔比星透明质酸纳米颗粒对口腔鳞状细胞癌作用

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1、多柔比星透明质酸纳米颗粒对口腔鳞状细胞癌作用：张晓燕金晓明刘晨光【摘要】目的探讨多柔比星透明质酸纳米颗粒于体外靶向杀伤口腔鳞状细胞癌的作用。方法在体外培养的口腔鳞状细胞癌细胞中分别加入多柔比星浓度为0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的多柔比星透明质酸纳米颗粒，利用体外细胞毒实验四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测多柔比星透明质酸纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向杀伤作用；多柔比星浓度为5.0、10.0mg/L时分别作用0、6、12、24、48h后，利用流式细胞仪检测其对肿瘤细胞凋亡影响。结果24、48

2、h细胞毒实验显示，多柔比星透明质酸纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用优于游离多柔比星(t=5.78～42.05,P<0.01)。相同浓度多柔比星透明质酸纳米颗粒细胞凋亡百分率随时间延长而升高（F=4200.40、4775.36,P<0.01）,相同作用时间细胞凋亡率随浓度增加而升高（t=12.06～20.08，P<0.05)。结论多柔比星透明质酸纳米颗粒可特异性识别肿瘤细胞，并实现其杀伤作用，而且随时间延长杀伤作用增大。【关键词】多柔比星；纳米结构；肿瘤,鳞状细胞；药物释放系统;药

3、物疗法多柔比星（ADM）是临床常用的抗恶性肿瘤药，但长期使用有很强的毒性作用[1]。纳米生物材料可大大提高药物载体的靶向性,降低药物的毒副作用[2]。将透明质酸（HA）与多柔比星联合制成纳米颗粒，可通过HA与透明质酸结合受体（RHAMM）及CD44的特异结合实现药物的特异投放，从而提高药物的靶向性，降低药物的毒副作用。本研究旨在探讨多柔比星透明质酸纳米颗粒（AHAN）于体外靶向杀伤口腔鳞状细胞癌的作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　人口腔鳞状细胞癌细胞株由上海第九人民医院陈万涛教授惠赠，AHA

4、N由刘晨光教授惠赠。　　1.2仪器与试剂　　1640培养基（上海卓康生物科技有限公司），新生小牛血清（中国杭州四季青生物工程公司），注射用多柔比星（每瓶10mg，浙江海正药业股份有限公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma公司），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），Rainbog的AHAN溶于1mL双蒸水，浸泡24h，超声粉碎颗粒，此时ADM浓度为156mg/L，高压灭菌备用。　　1.3.3细胞形态学观察及MTT比色法培养将检测细胞以5×107/L接种到96孔培养板中,每孔均为0.1mL

5、,待细胞生长融合为单层后,分别加入AHAN（AHAN组）、游离ADM（游离ADM组）和RPMI1640工作液(空白对照组)，AHAN、ADM组按ADM浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0mg/L设4组，每组设4个平行组。空白对照组加等量RPMI1640工作液。分别培养24、48h后于倒置显微镜下观察细胞形态的改变。MTT法计算存活率,细胞存活率＝试验组吸光度值/对照组吸光度值×100％,测定波长为570nm。　　1.3.4流式细胞仪测定细胞凋亡率将细胞以1×108/L接种于6孔板中，待细胞贴壁

6、后，分别将5、10mg/L的HAADMSSL作用于细胞0、6、12、24、48h后，将细胞用2.5g/L胰酶EDTA消化、离心收集，0.01mol/LPBS（pH7.4）洗2次，3000r/min离心5min，体积分数0.70冷乙醇固定细胞，加含RNA酶PI染液4℃作用30min，过网，调细胞浓度至109/L，流式细胞术检测细胞凋亡率。　　1.4统计学处理　　采用SPSS10.0及PPMS1.5[3]统计分析软件对数据进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异具有统

7、计学意义。　　2结果　　2.1各组细胞形态的变化　　加药24h后，空白对照组细胞形态无明显变化；游离ADM组和AHAN组均可见部分鳞状细胞癌细胞收缩，细胞变小变圆，有突起相互牵连，在细胞表面出现多数暗色颗粒，AHAN组同时可见细胞散在脱落。加药48h后，游离ADM组可见细胞多数收缩，AHAN组可见细胞几乎完全脱落，呈散在存在。　　2.2各组细胞存活率比较　　培养24、48h两组相同浓度细胞存活率比较差异有显著性(t=5.78～42.05,P<0.01)。见表1。　　2.3流式细胞术检测　　相同

8、浓度的AHAN细胞凋亡率随时间延长而升高（F=4200.40、4775.36,P<0.01），浓度为5.0、10.0mg/L作用0h两组间细胞凋亡率无显著差异（t=0.20,P>0.05）,分别作用6、12、24、48h两组凋亡率差异有显著性（t=12.06～20.08,P<0.05）。见表2。　　表1两组培养24、48h细胞存活率比较（略）　　表2不同浓度的AHAN对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡率的影响（略）3讨论　　肿瘤的靶向治疗是指借助各种对肿瘤细胞