足叶乙苷长循环脂质体的制备及血浆中稳定性研究

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1、足叶乙苷长循环脂质体的制备及血浆中稳定性研究作者：时军程怡陈伟鸿宿央央【摘要】　　[目的]研究足叶乙苷长循环脂质体的制备方法并考察其在大鼠血浆中的稳定性。[方法]采用乙醇注入法制备足叶乙苷长循环脂质体，用聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(PEG2000DSPE)修饰脂质体膜，反相高效液相色谱(HPLC)法测定脂质体浓度，动态透析法考察其在大鼠血浆中的稳定性。[结果]足叶乙苷长循环脂质体的平均粒径为(180±26)nm，含量为(4.78±0.22)mg/mL，药物包封率为(88.71±8.2)%。在大鼠

2、血浆中，普通脂质体和长循环脂质体24h累积释药率分别为(80.14±1.59)%和(46.72±2.61)%。[结论]乙醇注入法可制得包封率高、粒径小的足叶乙苷脂质体，PEG2000DSPE修饰脂质体膜可增加脂质体的稳定性。【关键词】足叶乙苷/生产和制备长循环脂质体/方法色谱法高压液相　　足叶乙苷(etoposide)为鬼臼毒素(podophyllotoxion)的半合成衍生物，临床上多用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病等[1-2]，但有较严重的骨髓抑制和消化道反应。足叶乙苷难溶于水及

3、许多药用溶剂，剂型有待于改进[3]。脂质体由于与机体有良好的生理相容性，是目前降低药物毒副作用、提高生物利用度的理想药物载体，但以传统的卵磷脂、胆固醇制备的常规脂质体进入循环系统后，在血液循环中滞留时间较短[4]。近年来研究表明[5]，将脂质体表面进行亲水改性，实现聚乙二醇化，将大大提高脂质体在血液循环中的稳定性，减少血浆调理蛋白的结合或破坏。本课题以聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(PEG2000DSPE)修饰脂质体膜，制备足叶乙苷长循环脂质体，并初步考察脂质体双层膜的稳定性。现报道如下。　　1材料

4、与方法　　1.1药品与试剂　　足叶乙苷(北京双鹤药业，批号：2007081105);注射用蛋黄卵磷脂(德国Lipoid公司);聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(德国Lipoid公司);胆固醇(中国医药公司北京采购供应站);十八胺(Sigma公司);SephadexG50(瑞典Pharmacia公司);甲醇、乙腈为色谱纯，其他药品、试剂均为国产分析纯。　　1.2仪器　　Zetasizer激光粒度测定仪(英国Malvern公司);UV1601紫外分光光度计(日本岛津);Dinonex高效液相色谱仪(P6

5、80型泵，PDA100型检测器，ASI100自动进样器，美国戴安公司);JY92Ⅱ超声细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);H600透射电子显微镜(日本Hitachi公司);901型恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂)。　　1.3足叶乙苷脂质体的制备　　采用乙醇注入法制备足叶乙苷脂质体[6]。将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺按摩尔比10：5：0.3精密称定，溶于足叶乙苷热乙醇液中，保温(55±2)℃，在搅拌下匀速注入乙醇液至pH7.410mL磷酸盐缓冲液(PBS,0.05mol/

6、L)中，注入过程中通入N2除去乙醇。注入完毕后，45℃孵育20min，探头式超声3min，再依次过0.8和0.45μm的微孔滤膜，即得足叶乙苷长循环脂质体(LCL)。同法制备普通脂质体(CL)，不同的是载体材料为卵磷脂、胆固醇、十八胺(摩尔比10：5：1.6)。　　1.4脂质体的形态、粒径大小和表面电荷的测定　　取样品适量，稀释，滴加磷钨酸染色液，混匀，用铜网蘸取混合液，干燥，于透射电镜下观察并照相。用激光粒径测量仪测定样品的平均粒径、Zeta表面电位。　　1.5脂质体中足叶乙苷含量的测定　　1.5.1紫外

7、光谱扫描将药物、含药脂质体和空白脂质体分别用TritonX100乙醇混合液溶解稀释后，于190～700nm处扫描，药物和含药脂质体在285nm处有最大吸收，磷脂、胆固醇等辅料无干扰。　　1.5.2测定方法反相高效液相色谱(HPLC)法测定足叶乙苷含量。色谱条件为固定相GeminiC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex)，流动相为甲醇-0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.0)(体积比为60：40)，流速：1.0mL/min，检测波长：285nm，柱温：30℃，进样量：20μL。

8、　　1.5.3标准曲线制备精密称取足叶乙苷对照品适量，用流动相溶解定容，制备成浓度为0.52mg/mL的足叶乙苷贮备液，精密量取上述贮备液，用流动相稀释成浓度分别为52、104、208、312、416μg/mL的系列标准品溶液，按照上述色谱条件进行操作。用测得的峰面积A与其浓度ρ进行回归，得到回归方程为A=0.1155ρ-0.2793，r=0.9998，结果表明足叶乙苷进样量在52～520μg/mL之间，线性关系