hsp90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用

《hsp90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、HSP90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用【摘要】目的：探讨人真皮成纤维细胞热损伤变性后HSP90的保护作用.方法：培养的人真皮成纤维细胞在52℃，30s热水损伤24h后用免疫荧光观察HSP90表达部位的改变并与正常组比较，用EM，新生小牛血清，载玻片20mL/L小牛血清封闭液，1∶25山羊HSP90一抗（Santacruz，美国)，FITC标记免抗山羊IgG(H+L)(二抗,武汉博士德)，5mL/LTritonX100打孔液，CeLLpticTMceLLLysisReagent(Sigma)，蛋白Marker，马抗人βactin一抗(Santacruz，美国)，山羊抗马

2、βactin二抗(Santacruz，美国).1.2方法1.2.1细胞培养取门诊手术切除的小儿包皮,用生理盐水清洗3次，10g/L碘伏浸泡5min，再用生理盐水清洗3次，在含有青霉素(1000万U/L)的生理盐水中剪除皮下脂肪组织和筋膜，将分离后皮肤转移到5mL锥形瓶中剪成糊状，加入2.5mL5g/L胰蛋白酶+0.2g/L乙二胺四乙(EDTA),在37℃，1000r/min恒温器下振荡1.5h，加含100mL/LFCS的DMEM2.5mL中和胰酶，用100目金筛网过滤，过滤液经1000g离心10min，收集细胞，以1×108/L接种于75mL玻璃培养瓶中，37℃，50mL/LCO2

3、孵箱中培养.24h后倒置显微镜观察有部分细胞贴壁，更换细胞培养液，更换下来的培养液重新离心获取细胞培养，前3d每日换液，以后视细胞生长情况3～5d换液一次，3～4L.正常组培养瓶浸入37℃液平面下30s，实验组则在52℃浴水中浸泡30s形成热损伤变性，分别于3，12，24，48，72，96，120h为时相点收集细胞进行检测，实验重复3次.1.2.3HSP90免疫组织化学荧光检测将正常组和实验组FB分别倒入置有载玻片的六孔培养板中，置于37℃,50mL/LCO2孵箱中培养1d，按常规方法进行免疫细胞化学染色，HSP90一抗，FITC标记免疫为二抗，阴性对照用0.01mmoL/SPBS代

4、替一抗，其余步骤不变.1.2.4HSP90ProteinAssaykit(Pierce)说明测定蛋白质浓度，分装后将其置于-70℃待用.每个样品取30μg蛋白质加入等体积3×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃煮沸5min，经100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，100V电转移PVDF膜1.5h，20g/LBSA室温封闭4h,加入1∶2000稀释HSP90一抗(Santacruz,美国)，4℃过夜，PBST洗膜，加1∶3000稀释生物素标记二抗(武汉博士德公司)，37℃孵育1h，PBST洗膜，滴加超敏曝光液(Pierce,美国)曝光，在GelDoc2000凝胶成像系统进行显影及行灰度值比较

5、.统计学处理：所有数据采用SPSS10.0进行处理,实验数据以目的产物与内参灰度值之比用x±s表示，各组间比较用单因素方差分析.2结果2.1FB热损伤后HSP90免疫荧光检测正常情况下FB中HSP90阳性染色弱，主要分布于胞质中，热损伤24h胞质内阳性着色显著增强，而且在一些胞核内还出现强阳性着色（图1，2）.2.2FB热损伤后HSP90WesternBlot结果FB热损伤后3hHSP90的表达即开始升高（x=0.365,n=4,P<0.05），24h达到高峰（x=1.031,n=4,P<0.05），维持到96h（x=0.732,n=4,P<0.05），120h恢复

6、到正常(x=0.10,n=4,P>0.05,图3).图1正常FBHSP90免疫荧光结果可见阳性荧光较弱,主要分布在细胞质中×100图2FB烫伤后24hHSP90免疫荧光结果,可见胞质中阳性荧光显著增强,且胞核内也出现较强的阳性荧光×100图3严重烫伤FBHSP90WesternBlot结果3讨论成纤维细胞是创伤修复的主要细胞［1］.深Ⅱ°烧伤创面处理的研究一直是烧伤界的热点［4］，但深Ⅱ°创面间生态和残存真皮中的损伤的FB变化转归却一直被忽视.目前国内外还没有一个较好的深Ⅱ°创面FB热变性的细胞模型［5］.Caitlin等［6］提出了51.5℃，30s为NIH3T3热变性损伤模

7、型.我们通过反复预实验，发现52℃，30s造成的FB热损伤符合细胞变性的形态学特点：胞膜完整，少量微绒毛,胞质中有大量空泡变性,线粒体肿胀,髓鞘样改变,内质网扩张明显,核质比例小,核仁不明显.经过一段时间后其形态、结构和功能均能恢复.以往人们对HSP70在损伤中的作用研究较多，但对HSP90在FB热变性的转归中的变化却少见报道.热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)是一簇在结构上高度保守的多肽，广泛存在于生物细胞中，参与细胞内损伤蛋白的修复