滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究

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1、滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究作者：战丽彬,钟军华,路小光,隋华,韦巍【关键词】内质网;衣霉素;葡萄糖调节蛋白78;凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白;小鼠　　内质网（endoplasmicreticulum,ER）广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激（endoplasmicreticulumstress,ERS），发生具有保护作用的未折叠蛋白反应（unfoldedprotEinresponse,UPR）。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修

2、复、损伤或凋亡。神经系统许多疾病与内质网应激相关。最近的研究表明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病（AlzhEImerdisease,AD）的发病有关。本研究观察滋补脾阴方药（ZibuPiyinRecipe,ZBPYR）含药血清对由N糖链抑制剂衣霉素（tunicamycin,Tm）引起的内质网应激的影响，以探讨其神经保护机制。　　1材料与方法　　1.1实验药物滋补脾阴方药由清代吴澄《不居集》中资成汤加味而成，由红参30g，山药15g，茯苓15g，白芍15g，丹参12g，白扁豆15g，莲肉20g，石菖蒲10g，远志10g，檀香4.5g，橘红9g，甘草9g组成，均

3、购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药3.29g，4℃保存备用。　　1.2主要试剂和仪器达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM)和胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司产品；Tm，星形孢菌素（staurosporine,STS），日本公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。　　1.3中药血清制备取健康雄性SD大鼠（220～250ｇ）12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10ml/kg体质量，此剂量灌

4、胃2次/d，连续3d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后1h腹主动脉取血，静置2h，2000r/min，4℃离心15min分离血清，离心半径为16.1cm，56℃，30min灭活。0.22μm滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。　　1.4Neuro2a细胞的培养小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规复苏后加入培养液于5%CO2、37℃培养箱培养。细胞单层长满后用终浓度为0.25%胰蛋白酶37℃条件下消化3min，以1∶3传代。培养液含90%DMEM、10%胎牛血清和1％双抗。细胞长至第三代可以使用。　　1.5乳酸脱氢酶释放试验Ne

5、uro2a细胞接种后分为对照组、10％空白血清组、5％ZBPYR组、10％ZBPYR组、15％ZBPYR组、Tm（5μg/ml）组、10％空白血清＋Tm（5μg/ml）组、5％ZBPYR＋Tm（5μg/ml）组、10％ZBPYR＋Tm（5μg/ml）组、15％ZBPYR＋Tm（5μg/ml）组。细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养48h后用乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）释放试验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性

6、测定用酶标仪于490nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS（0.1μmol/L）组、10％空白血清＋STS（0.1μmol/L）组、15％ZBPYR＋STS（0.1μmol/L）组，待细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养48h后检测LDH泄漏率。　　1.6逆转录聚合酶链式反应实验分组同前。细胞单层长至90％时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养6h。总RNA的提取和逆转录聚合酶链式反应。（1）收集细胞用TRIReagent提取总RNA。用紫外分光光度计测定A260/A280，计

7、算RNA浓度。（2）逆转录反应。反应体系为20μl。取2μg总RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethylpyrocarbonate,DEPC）水至总体积为9μl，加0.5μlOligo(dt)1218引物混合后，置70℃变性10min。然后加入下列成分：5×第一链缓冲液5.875μl、10mmol/LdNTP2μl、0.1mol/LDTT2μl、RNase抑制剂0.5μl和逆转录酶0.125μl，混合使反应总体系为20μl。放入46℃反应1.5h，70℃变性15min，冰上5mi