pten抑制剂保护缺血神经元机制的研究

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1、PTEN抑制剂保护缺血神经元机制的研究：尹晓慧齐素华许静韩东张光毅【摘要】目的研究PTEN抑制剂pic与脑缺血诱导的海马CA1区神经元损伤及复灌过程中Akt1活化变化的关系，来揭示pic保护缺血神经元的机制，从而为更清楚地了解缺血性神经元损伤的机制提供新的依据。方法实验分为空白对照组、缺血对照组、溶剂对照组及pic组。通过四动脉结扎建立大鼠全脑缺血模型，在缺血前腹腔注射溶剂或PTEN的特异性抑制剂pic。采用免疫印迹方法检测大鼠海马中Akt1活化情况的变化。通过焦油紫染色观察海马神经元的存活情况。结果给予pic后，海马神

2、经元中Akt1活化程度较对照组明显升高（n=3）,同时海马CA1区存活神经元也较对照组明显增加（n=5）。结论pic通过抑制PTEN而激活Akt1，从而保护缺血神经元。【关键词】脑缺血PTENpicAkt1多年来对于Akt的大量研究表明，Akt是一种与细胞生长、存活相关的蛋白。生长因子受体的活化能够激活PI3K/Akt信号通路。我们实验室过去的研究显示，具有神经元保护作用的预缺血处理也能激活PI3K/Akt信号通路［1］。Akt是一种蛋白激酶，它通过磷酸化其下游底物而传递细胞信号。其直接的上游激活蛋白并不是PI3K，而是

3、另外一些蛋白，比如PDK。这些蛋白磷酸化Akt的308位酪氨酸或473位丝氨酸而将其激活［2~4］。Akt的激活除了需要PDK等，还必须有一种非蛋白物质的参与，那就是PIP3。而PIP3则是位于细胞膜内侧的PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成的［5-6］。PI3K/Akt信号通路本身是一个促进细胞生长、存活、分化的信号通路，但同时它还影响着其他的信号通路。在缺血耐受的研究中发现，PI3K/Akt信号通路介导了缺血耐受中MLK3/JNK信号通路的抑制［1］。MLK3/JNK信号通路是介导缺血性神经元损伤的重要信号通路，这一

4、观点目前已得到公认。作为MAPK信号通路的上游蛋白，MLK3可以被Akt磷酸化而负性调节，因此，Akt能够通过抑制MLK3/JNK信号通路而介导预缺血的神经元保护作用［7-8］。1997年，科学家们发现了一种新的蛋白PTEN。虽然对于它的研究时间并不长，但是它的重要生物学作用早已引起了广泛关注。首先，PTEN是一种抑癌因子，它通过负性调节Akt来介导肿瘤抑制作用［9-10］。而我们这里不想讨论它的抑癌机制，我们关心的是它的2种磷酸酶活性，即磷脂酶和蛋白磷酸酶活性。PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成PIP3，从而介导Ak

5、t的活化［5-6］。PTEN却可以发挥它的磷脂酶活性使PIP3脱磷酸，这样PTEN就抑制了PI3K/Akt信号通路［9］。PTEN的蛋白磷酸酶活性则可以以Shc为底物［11］。Shc是MAPK信号通路活化的重要信号分子。因此PTEN可以直接抑制MAPK信号通路。pic是PTEN的抑制剂，目前已被广泛地应用于科学研究。这里我们是想通过研究pic对缺血复灌中Akt1活化的影响来揭示pic保护缺血神经元的机制。1材料和方法1.1SD大鼠脑缺血/再灌注模型的建立按本室已建立的大鼠四动脉结扎模型，实验动物随机分为空白对照组、缺血对

6、照组、溶剂对照组和pic组。动物以20%水合氯醛（300~350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第3天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15min，然后再灌注10min或5天。以缺血动物体征及表现判断缺血模型的可靠性。空白对照组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。1.2给药pic溶于生理盐水（0.25g/L），以1mg/kg的剂量分5次于手术后第2天腹腔注射，每次间隔2h，1天内注射完。以相同体积的生理盐水腹腔注射作为阴性对照。1.3样品制备大鼠缺血/再灌注后，断头快速取脑，分离双

7、侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液,用Glas－col匀浆器高速匀浆（10s×6次），4℃下800g离心15min，小心移取上清液（主要为海马的胞质部分）。1.4蛋白含量测定按Loage图像分析软件处理。1.6组织学检查方法于复灌第5天，以水合氯醛麻醉大鼠。接着以生理盐水和4％多聚甲醛行心室灌注。取脑放于4℃同样的多聚甲醛中后固定1天以上。然后将脑块放于梯度乙醇溶液中脱水并于二甲苯中透明。包蜡后的脑块切片（5μm厚），经脱蜡，脱二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。1.7统计学处

8、理数据以x±s表示，统计分析采用方差分析（ANOVA），组间比较采用SigmaStat统计软件处理，P<0.05为统计学差异有显著性。2结果2.1pic对缺血后神经元有显著保护作用为了更明确揭示PTEN是否介导了缺血性神经元损伤，我们应用焦油紫对大鼠脑切片进行染色，来检测神经元的存活情况。结果显示，与空白对照组