pten抑制剂保护缺血神经元机制的研究论文

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1、PTEN抑制剂保护缺血神经元机制的研究论文尹晓慧齐素华许静韩东张光毅【摘要】目的研究PTEN抑制剂pic与脑缺血诱导的海马CA1区神经元损伤及复灌过程中Akt1活化变化的关系,来揭示pic保护缺血神经元的机制,从而为更清楚地了解缺血性神经元损伤的机制提供新的依据。方法实验分为空白对照组、缺血对照组、溶剂对照组及pic组。通过四动脉结扎建立大鼠全脑缺血模型,在缺血前腹腔注射溶剂或PTEN的特异性抑制剂pic。采用免疫印迹方法检测大鼠海马中Akt1活化情况的变化。通过焦油紫染色观察海马神经元的存活情况。结果给予pic后,海马神经元中Akt1活化程度较对照组明显升高(n=3),同时海马CA1

2、区存活神经元也较对照组明显增加(n=5)。结论pic通过抑制PTEN而激活Akt1,从而保护缺血神经元。【关键词】脑缺血PTENpicAkt1多年来对于Akt的大量研究表明,Akt是一种与细胞生长、存活相关的蛋白。生长因子受体的活化能够激活PI3K/Akt信号通路。我们实验室过去的研究显示,具有神经元保护作用的预缺血处理也能激活PI3K/Akt信号通路[1]。Akt是一种蛋白激酶.freelg/kg)腹腔注射麻醉后,分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第3天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉,使全脑缺血15min,然后再灌注10min或5天。以缺血动物体征及表现判断缺血模型的可靠性。空白对

3、照组处理同实验组,但不结扎双侧颈总动脉。1.2给药pic溶于生理盐水(0.25g/L),以1mg/kg的剂量分5次于手术后第2天腹腔注射,每次间隔2h,1天内注射完。以相同体积的生理盐水腹腔注射作为阴性对照。1.3样品制备大鼠缺血/再灌注后,断头快速取脑,分离双侧海马,置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行:从液氮中取出海马加匀浆缓冲液,用Glas-col匀浆器高速匀浆(10s×6次),4℃下800g离心15min,小心移取上清液(主要为海马的胞质部分)。1.4蛋白含量测定按Loage图像分析软件处理。1.6组织学检查方法于复灌第5天,以水合氯醛麻醉大鼠。接着以生理盐水和4%多聚甲

4、醛行心室灌注。取脑放于4℃同样的多聚甲醛中后固定1天以上。然后将脑块放于梯度乙醇溶液中脱水并于二甲苯中透明。包蜡后的脑块切片(5μm厚),经脱蜡,脱二甲苯,最后放于焦油紫溶液中染色。1.7统计学处理数据以x±s表示,统计分析采用方差分析(ANOVA),组间比较采用SigmaStat统计软件处理,P0.05为统计学差异有显著性。2结果2.1pic对缺血后神经元有显著保护作用为了更明确揭示PTEN是否介导了缺血性神经元损伤,我们应用焦油紫对大鼠脑切片进行染色,来检测神经元的存活情况。结果显示,与空白对照组相比,缺血对照组及溶剂对照组的存活神经元分别为(10.2±1.4)%和(8.9±2.7

5、)%;而pic组存活细胞增加至(45.0±3.2)%(n=5,P0.05)。见图1。2.2pic显著增强了Akt1的活化如前面所述,Akt是一种保护性蛋白,它介导的信号通路与细胞的存活、生长有关。而Akt活化所必需的PIP3则受PTEN的负性调节。所以这里,我们通过检测给予PTEN的抑制剂pic后,海马神经元内Akt1的磷酸化水平来反映PTEN在缺血性神经元损伤中所发挥的作用。结果如图1所示,与空白对照组相比,缺血对照组及溶剂对照组大鼠海马神经元内Akt1的磷酸化水平没有明显的变化。pic组与各对照组相比却表现出了Akt1磷酸化水平的显著增高(n=3,P0.05)。各组间Akt1表达水

6、平没有明显变化。见图2。3讨论缺血性疾病,例如脑缺血、心肌缺血、胃缺血,是一类发病率很高的疾病,严重地危害着人类的健康。因此,明确其发病机制,寻求其预防和治疗的方法已成为一项重要而艰巨的任务。对于脑缺血性疾病的研究已取得很大的进展。其中,MAPK信号通路在介导缺血性神经元损伤中发挥的作用已比较明确。MAPK信号通路是一条蛋白激酶级联反应信号通路。其上游以MLK3为代表的MAPKKK通过磷酸化反应激活其下游的多种蛋白激酶,继而产生一系列生物学效应,介导神经元损伤。然而,细胞内的信号通路并不是一条一条相互独立的,它们通过信号分子之间的相互作用而交织成复杂的网络。比如,Akt是一种保护性蛋白

7、激酶,它通过磷酸化反应激活其下游蛋白,从而产生一系列与细胞生长、存活有关的生物学效应。除此之外,Akt还能够磷酸化MLK3的674位苏氨酸。这一磷酸化反应是对MLK3活性的负性调节,抑制了MAPK信号通路,与Akt的保护性作用是一致的[7-8]。在神经元的缺血耐受中,Akt1就是通过这样的方式介导了预缺血的神经元保护作用[1]。损伤性信号与保护性信号在细胞内同时存在而且相互作用。有研究结果显示,缺血/再灌注12h胞内Akt1的活化水平有明显升高

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