制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究

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1、制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究作者：戈宏焱杨金刚房学讯赵树华李有田【摘要】目的研究制半夏对基质金属蛋白酶-16（MMP-16）活性的抑制作用。方法根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理，通过检测底物降解速率，测定中药制半夏对MMP-16的抑制作用。结果与空白对照组及阳性对照组相比，制半夏具有较强的抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=23μg/ml。结论半夏水煎剂在体外具有抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性较强，且存在剂量依赖关系。【关键词】制半夏；基质金属蛋白酶；酶活

2、性分析；抗肿瘤　　Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryactionofpinelliaetuberonmatrixmetalloprotEinase-16(MMP-16).MethodsThedecreasingofthedegraderateofsubstrateisassociatedatrixmetalloprotEInase-16.MPbyobservingthedegraderateofsubstrate.ResultsPinelliaetuberstrong

3、lyinhibitedtheactivityofMMP-16,andtheIC50l.ConclusionTheapozemofpinelliaetuberhasinhibitoryactivityonMMP-16inadose-dependentmannerinvivo.　　Keyetalloproteinase;Methodsfortheanalysisofenzymaticactivity　　我国传统中药半夏Pinelliaetuber具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。长期的临床实践表明半夏具有确

4、切的疗效。半夏生品有小毒，临床上内服必须经过炮制或与生姜配伍以减轻毒性，故本实验所用半夏均为临床应用广泛的炮制半夏。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的蛋白水解酶家族，能够降解细胞外基质成分，参与众多重要的生理和病理过程［1］。根据报道,MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响［2～4］。本实验研究制半夏体外抑制基质金属蛋白酶－16活性的作用及抗肿瘤机理，从而为从分子水平上研究半夏的治病机理奠定基础，也为进一步从半夏中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。　　1器材　　1.1材料制半夏（吉林大学

5、中日联谊医院中药房提供的道地药材），自制缓冲溶液（50mmol/LHEPES，0.2MNaCl，10mmol/LCaCl2，20μmol/LZnSO4，0.05%Brij-35）,荧光底物DQ-gelatin（美国Sigma公司），已知广谱MMP的抑制药物15nmol/LGM6001。　　1.2仪器Bio-RedFLx-800荧光酶标仪(美国),DPX-9082B-1点热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)。　　2原理与方法　　2.1原理实验所用底物为荧光底物，酶降解底物后发荧光，通过荧光酶标仪检测反应体系

6、的荧光强度变化。抑制活性的测定是在反应体系中加入半夏提取物，提取物中抑制成分与酶结合，占据酶的活性中心，使底物不能与酶结合，从而导致酶降解底物速率降低，荧光强度变化减慢。　　2.2方法　　2.2.1分组分为空白对照组（反应体系中不加入任何药物）、阳性对照组（反应体系中加入已知mmp抑制药物GM6001）、半夏水提物不同浓度组（加入不同浓度半夏水提物）。　　2.2.2提取物的制备将3g半夏放入水中沸水煮3h，然后过滤得到水煮溶液，将水煮溶液低温冻干，得到半夏水提取物。配制浓度为0.4，1.2，2，2.8和3.6

7、mg/ml的水提取物溶液。　　2.2.3抑制活性的测定将一定量的MMP-16分别与1μl不同浓度的半夏水提取物（0.4，1.2，2，2.8和3.6mg/ml）、1μl无菌蒸馏水、1μl15nmol/L的GM6001加入96孔酶标板中，然后加入缓冲溶液（50mmol/LHEPES，0.2MNaCl，10mmol/LCaCl2，20μmol/LZnSO4,0.05%Brij-35），使终体积为50μl，放入37℃培养箱中孵育30min，然后加入含有0.2μgDQ-gelatin的缓冲溶液50μl，最终反应体系为1

8、00μl，制半夏水提取物最终浓度分别为4,12，20，28和36μg/ml，立即用Bio-RedFLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长为460nmol/L发射波长为520nM。检测10min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强弱。　　2.2.4抑制活性计算Vi代表加入抑制剂组的荧光强度变化，用Vo代表没有加入抑制剂组的荧光强度变化，抑制剂的抑制百分数用下边的公式计算：抑制百分数（%）=1