制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究论文

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1、制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究论文戈宏焱杨金刚房学讯赵树华李有田【摘要】目的研究制半夏对基质金属蛋白酶-16（MMP-16）活性的抑制作用。方法根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理，通过检测底物降解速率，测定中药制半夏对MMP-16的抑制作用。结果与空白对照组及阳性对照组相比，制半夏具有较强的抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=23μg/ml。结论半夏水煎剂在体外具有抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性较强，且存在剂量依赖关系。【关键词】制半夏；基质金属蛋白酶；酶

2、活性分析；抗肿瘤Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryactionofpinelliaetuberonmatrixmetalloproteinase-16(MMP-16).MethodsThedecreasingofthedegraderateofsubstrateisassociatedatrixmetalloproteinase-16.MPbyobservingthedegraderateofsubstrate.ResultsPinelliaetuberstron

3、glyinhibitedtheactivityofMMP-16,andtheIC50l.ConclusionTheapozemofpinelliaetuberhasinhibitoryactivityonMMP-16inadose-dependentmannerinvivo.Keyetalloproteinase;Methodsfortheanalysisofenzymaticactivity我国传统中药半夏Pinelliaetuber具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。长期的临床实践表明半夏具有确切

4、的疗效。半夏生品有小毒，临床上内服必须经过炮制或与生姜配伍以减轻毒性.freelmol/LHEPES，0.2MNaCl，10mmol/LCaCl2，20μmol/LZnSO4，0.05%Brij-35）,荧光底物DQ-gelatin（美国Sigma公司），已知广谱MMP的抑制药物15nmol/LGM6001。1.2仪器Bio-RedFLx-800荧光酶标仪(美国),DPX-9082B-1点热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)。2原理与方法2.1原理实验所用底物为荧光底物，酶降解底物后发荧光，通过荧光酶

5、标仪检测反应体系的荧光强度变化。抑制活性的测定是在反应体系中加入半夏提取物，提取物中抑制成分与酶结合，占据酶的活性中心，使底物不能与酶结合，从而导致酶降解底物速率降低，荧光强度变化减慢。2.2方法2.2.1分组分为空白对照组（反应体系中不加入任何药物）、阳性对照组（反应体系中加入已知mmp抑制药物GM6001）、半夏水提物不同浓度组（加入不同浓度半夏水提物）。2.2.2提取物的制备将3g半夏放入水中沸水煮3h，然后过滤得到水煮溶液，将水煮溶液低温冻干，得到半夏水提取物。配制浓度为0.4，1.2，2，2.8

6、和3.6mg/ml的水提取物溶液。2.2.3抑制活性的测定将一定量的MMP-16分别与1μl不同浓度的半夏水提取物（0.4，1.2，2，2.8和3.6mg/ml）、1μl无菌蒸馏水、1μl15nmol/L的GM6001加入96孔酶标板中，然后加入缓冲溶液（50mmol/LHEPES，0.2MNaCl，10mmol/LCaCl2，20μmol/LZnSO4,0.05%Brij-35），使终体积为50μl，放入37℃培养箱中孵育30min，然后加入含有0.2μgDQ-gelatin的缓冲溶液50μl，最终反应

7、体系为100μl，制半夏水提取物最终浓度分别为4,12，20，28和36μg/ml，立即用Bio-RedFLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长为460nmol/L发射波长为520nM。检测10min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强弱。2.2.4抑制活性计算Vi代表加入抑制剂组的荧光强度变化，用Vo代表没有加入抑制剂组的荧光强度变化，抑制剂的抑制百分数用下边的公式计算：抑制百分数（%）=1-Vi/Vo,当抑制百分数为50%时，则为此抑制剂抑制酶活性的IC50。3结果图1～7分别是空白对照组与

8、半夏水提物浓度分别为4，12，20，28和36μg/ml的实验组及阳性对照组的测定结果，图中“MeanV”表示随时间变化的荧光强度的变化速率，可以作为相对的底物降解速率，根据实验方法中所给出的公式，能够计算出不同浓度的半夏提取物对MMP-16的抑制百分数。通过以上数据，能够推测MMP-16的活性抑制50%时所需要的半夏的量，见图8，IC50=23μg/ml。图1空白对照组（略）图24μg·ml-1半夏水提物的测定结果（略）图3