epo模拟肽基因4串联体的构建和表达

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1、EPO模拟肽基因4串联体的构建和表达　　摘要:目的克隆和表达EPO模拟肽基因4串联体.方法设计了特殊的基因串联方案，在人工合成EPO模拟肽全基因的基础上，将EPO模拟肽基因由单体逐步地连接成4串联体.继而将获得的正确EPO模拟肽4串联体插入pBV220表达载体诱导表达.结果构建的EPO模拟肽基因4串联体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同.EPO模拟肽4串联体插入pBV220载体后，重组菌经42℃诱导4h，SDS-PAGE分析结果显示，该串联体得到较高水平的表达.凝胶扫描结果表明，其表达量约占菌体蛋白总量的20%.结论EPO模拟肽基因4串联体的

2、构建与表达均获得了成功.　　Keyimeticpeptide;geneexpression;Escherichiacoli　　Abstract:AIMTocloneandtoexpress4repeatsofEPOmimeticpeptidegene.METHODSP1）序列，选择大肠杆菌高频密码子设计合成该基因序列，EPO模拟肽合成全基因序列如下:在基因的两端加入了EcoRI，XbaI，BamHI和NheI限制性内切酶位点，以便于构建串联体和克隆.在NheI位点后和XbaI位点前加入了蛋氨酸密码子，以便于表达串联体之后将其裂解为单体.DNA合成由上海生物工程公司完成.　　1.

3、2方法①基因重组:质粒DNA的提取、酶切、片段回收、连接和转化均参照文献［2］进行.②SDS-PAGE:胶浓度为150g・L-1，取1mL培养菌液离心收集菌体，加2×上样缓冲液煮沸，离心后上样电EcoRIXbaI5’AATTCATGTCTAGAATGGGTGGTACTTACTCTTGCCACTTCGGTCCGCTGACTTGGGTTTGCGTACGAGTCTTACCCACCATGAATGAGAACGGTGAAGCCAGGCGACTGAACCCAAACGNheIBamHIAAACCGCAGGGTGGTATGGCTAGCTAG3’TTTGGCGACCCACCATACC

4、GATCGATCCTAG泳，电泳毕以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果.③DNA测序:均采用PE公司377型全自动序列分析仪进行.④EPO模拟肽基因4串联体的构建:将合成的EPO模拟肽全基因片段溶解于适量水中，在65℃水浴加热10min后缓慢降至室温.退火的DNA片段与经EcoRI和BamHI酶切的pBS质粒DNA连接和转化，挑取重组菌落提取DNA，以XbaI酶切初步鉴定后进行DNA测序.将获得正确序列的质粒命名为pBSEPOM1，取此质粒DNA两份，一份用NheI和ScaI酶切后电泳回收小片段;另一份用XbaI和ScaI消化后电泳回收大片段.将上述回收的两个酶切片段连接

5、后转化，提取DNA经测序确定正确重组克隆，此克隆即为EPO模拟肽基因的2串联体，命名为pBSEPOM2.再用pBSEPOM2质粒DNA按上述构建pBSEPOM2的方法操作，即可获得4串联体，命名为pBSEPOM4（Fig1）.获得的pBSE-POM4经酶切鉴定和DNA测序确定其序列.⑤EPO模拟肽基因4串联体的表达:将获得的pBSEPOM4DNA用EcoRI和BamHI酶切后回收小片段（4串联体），与经相同内切酶消化处理的pBV220DNA连接后转化DH5α菌株，提取重组质粒DNA，以EcoRI和BamHI酶切鉴定，得到有插入片段的正确克隆，命名为pBVEPOM4.将含有pBV

6、EPOM4的菌液接种于5mLLB培养基中30℃活化过夜，次日按1.5∶100的比例接种于LB培养基中，30℃培养至指数生长中期，迅速转至42℃培养4～5h，离心收集菌体，做SDS-PAGE分析.　　2.2pBVEPOM4的表达含重组pBVEPOM4的菌株诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在42℃诱导后，含pBVEPOM4细菌裂解上清中出现了一条分子质量约为12ku的新蛋白带，其分子量大小与理论计算值相符（Fig4）.凝胶经薄层扫描仪扫描，结果表明重组的EPO模拟肽基因4串联体的表达量占菌体总蛋白的20%左右（Fig4）.　　图1－图4略　　3讨论　　以往构建基因串联体的多采用

7、随机串联的方式来获得串联体［3］，此种方法的缺点是:偶然性很强，无法人为控制串联体的大小，且往往最终得不到串联体.与之相比，本研究构建基因串联体的方式有所不同，即采用特定的限制性内切酶位点来构建串联体.我们选择了XbaI和NheI两个有相同配伍末端的内切酶，分别将它们设计在EPO模拟肽基因的5’和3’末端，当用XbaI和ScaI酶切pBSEPOM1质粒时，回收的大片段中含有一个EPO模拟肽基因;当用NheI和ScaI酶切pBSEPOM1质粒时，回收的小片段中也含有一个EPO模拟肽基因，将此两