基因串联体下丽蝇抗病毒肽alloferon1的构

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1、基因串联体下丽蝇抗病毒肽Alloferon1的构【关键字】医学，抗病毒肽抗病毒肽抗病毒肽抗病毒肽【摘要】目的：克隆和表达Alloferon1基因2串联体.方法：利用同尾酶法基因同向串联方案，在人工合成Alloferon1全基因的基础上，将Alloferon1基因由单体连接成2串联体，继而将获得的正确Alloferon1基因2串联体插入pGEX4T1表达载体诱导表达.结果：构建的Alloferon1基因2串联体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同.Allofe

2、ron1基因2串联体插入pGEX4T1载体后，重组菌经37℃诱导4h，SDSPAGE分析结果显示，该串联体得到较高水平的表达.结论：Alloferon1基因2串联体的构建与表达均获得了成功.【关键词】抗病毒肽；基因,Alloferon1；同尾酶；同向串联；大肠杆菌　【Abstract】AIM：TocloneandexpressatandemofrepeatedgenerebinantplasmidpGEX4T1(Alloferon1)2.METHODS：ethod.Thentheco

3、rrecttandemofgenerepeatsedigestionanalysisshoofAlloferon1geneoleculemassof32×103of2repeatsofAlloferon1geneisconstructedandexpressedinE.colisuccessfully.　　【Keyer；tandem；Escherichiacoli　　0引言　　Alloferon1是俄国科学家Chernysh等［1］于2002年从人工干预热灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌丽蝇幼虫血淋

4、巴中分离得到的一种抗病毒和抗肿瘤的小肽，是由13个氨基酸残基组成的阳离子肽，其一级结构与昆虫防御素，天蚕素，富含脯氨酸的抗菌肽相似.研究表明Alloferon1对甲型乙型流感病毒、肝炎病毒和慢性髓性白血病K562细胞均有抑制作用，是一个具有潜在应用价值的小活性肽.由于其分子质量较小，克隆、表达、纯化、检测都会有一定难度，本实验拟采用同尾酶法基因同向串联的方法［2］，将Alloferon1基因串联起来，构建该基因的2串联体后表达该串联体，以增加其稳定性和表达量，为进一步的纯化和生物活性测定奠定基础

5、.　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α，质粒pGEX4T1均为本室保存；质粒pUC18，T4PNK，限制酶，Xgal，DNAmaker，IPTG均购自TaKaRa公司，UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒，小量质粒提取试剂盒均购自天根公司，其它试剂均为国产分析纯，基因由上海生工合成.　　1.2方法　　1.2.1Alloferon1基因的设计与合成根据瑞士微生物肽数据库（APD）收录的Alloferon1氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱密码子设计合成该基因序列，利用XbaI和NheI互

6、为同尾酶的特点，在基因的两端加入了EcoRI，SalI限制性内切酶切割后的粘性末端和XbaI，NheI限制性内切酶位点，以便于构建串联体和表达．在XbaI位点后和NheI位点前加入蛋氨酸密码子，以便于表达串联体之后将其裂解为单体.　　1.2.2Alloferon1基因的复性、磷酸化和纯化将合成的Alloferon1全基因片段溶解于适量灭菌双蒸水中，95℃水浴5min后，关闭水浴锅自然冷却至30℃以下.退火的Alloferon1基因片段用T4PNK进行磷酸化，37℃水浴30min，70℃水浴灭活1

7、0min.磷酸化后的Alloferon1基因片段用乙醇沉淀的标准方法回收.　　1.2.3Alloferon1基因2串联体的构建将Alloferon1基因与用EcoRI和SalI限制性消化的pUC18DNA连接后转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选出克隆重组子.将上述克隆重组子以NheI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的克隆重组质粒命名为pUC18Alloferon1.取上述重组质粒两份，一份用ScaI和XbaI双酶切后回收大片段，另一份用ScaI和NheI双酶切后回收小片段，将上述

8、回收的大小片段连接后转化大肠杆菌DH5α.通过蓝白斑筛选出2串联体克隆重组子.将上述重组子用EcoRI和SalI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的2串联体克隆重组质粒命名为pUC18(Alloferon1)2.以上过程均参照文献［3］进行.　　1.2.4Alloferon1基因2串联体的表达将获得的2串联体重组质粒pUC18(Alloferon1)2用EcoRI和SalI酶切后回收小片段（2串联体），与经相同内切酶消化处理的pGEX4T1DNA连接转化BL21菌株，提取重组质