改变部分tir对epo模拟肽8串联体表达的影响论文

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1、改变部分TIR对EPO模拟肽8串联体表达的影响论文.freelHI位点，诱导表达.结果DNA测序证明，人工合成的DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因8串联体的翻译起始区域.该串联体基因插入pBV220载体后，经42℃诱导.freelimeticpeptide;genemultiplerepeatsAbstract:AIMToobserveeffectofasynthesizedDNAse-quenceoftranslationinitiationregion（TIR）onexpressionof8repeatsofEOPmimeticpeptidegene.METHODSAD

2、NAsequenceoftranslationinitiationregionimeticpeptidegene.ThecorrectrebinantplasmidDNAedforpBSE-POM8B.Then8repeatsofEPOmimeticpeptidegeneHIsitesofpBV220expressionvector.RESULTSDNAsequencinganalysisshobentbacteriumcontainedpB-VEPOM8Boleculemassoftheneimeticpeptide.Theproteinbandamount-edto15%

3、oftotalbacteriaprotein.CONCLUSIONSynthe-sizedDNAsequenceofTIRinitiatestranslationof8repeatsofEPOmimeticpeptidegene，andsohelpsimprovethepre-viouslynon-expressionofthelatter.0引言EPO模拟肽是8质粒（含EPO模拟肽基因8串联体序列）由本中心构建，pBV220表达载体、DH5α菌株均为本中心保存.各种限制性内切酶购于Gibco公司和上海生物工程公司.②部分TIR序列的设计与合成全序列设计共38bp，在序列的两

4、端分别设计了EcoRI和XbaI酶切位点，便于克隆.SD序列与起始码的距离为7bp.起始码后加入3个氨基酸密码子，设计合成序列如下:EcoRISD5’AATTCACATTGCAAGGAGTTTATAAATGAGTATCGATTGTGTAACGTTCCTCAAATATTTACTCATAGCTAAGATC3’XbaIDNA序列的合成由上海生物工程公司完成.1.2方法①所有的质粒DNA提取、消化、回收片段与连接转化均参照文献进行［2］.②SDS-PAGE参照文献进行［2］.③DNA测序采用PE公司377型全自动序列分析仪进行.④合成的TIR序列与EPO模拟肽基因8串联体的重组将合成

5、的DNA片段加水溶解，在65℃水浴中加热10min，退火.取pBSE-POM8质粒DNA以EcoRI和XbaI酶切后回收大片段，将此大片段与上述退火的DNA片段连接后转化DH5α感受态细胞，挑取转化菌落培养后提取质粒DNA进行DNA测序，获得的正确序列重组质粒称为pBSEPOM8B.构建过程如Fig1所示.⑤pBVE-POM8B表达载体的构建及诱导表达以EcoRI和BamHI酶切pBSEPOM8B质粒DNA，电泳回收EPO模拟肽基因8串联体（含改变的TIR序列）小片段，将此小片段插入经相同内切酶消化的pBV220载体，转化后挑取重组菌落培养，提取质粒DNA，以EcoRI和Ba

6、mHI酶切鉴定.将含正确重组质粒pB-VEPOM8B的菌液以1∶100接种于5mLLB培养基中，30℃培养过夜，次日以1.5∶100转接LB培养基后30℃培养至指数生长期，迅速转至42℃继续培养4h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析.2结果2.1TIR序列与EPO模拟肽基因8串联体重组的鉴定按照设计的重组方案获得了若干重组菌落，提取质粒DNA后进行了DNA测序分析，结果表明合成的部分TIR序列已正确地插入翻译起始区域，和设计序列完全相同.图1略2.2pBV220EPOM8B的构建与表达鉴定重组的pBVEPOM8B经EcoRI和BamHI酶切后，电泳鉴定结果（Fig2）表

7、明，EPO模拟肽基因8串联体（含合成的TIR序列）已成功克隆到pBV220表达载体中，酶切小片段约为680bp，与理论计算值相符.含有上述pBVEPOM8B重组菌42℃诱导4h后，经SDS-PAGE分析，结果（Fig3）表明在裂解上清中出现了一条新的蛋白质带，其相对分子质量约为22×103，该相对分子质量与理论计算值相符，即EPO模拟肽基因8串联体基因获得了表达.经薄层扫描仪扫描，其表达量约占菌体总蛋白的15%.3讨论影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素虽有多种，但主要集中在两个方面:一个是对转录水平的影