epo模拟肽基因4串联体的构建和表达论文

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1、EPO模拟肽基因4串联体的构建和表达论文韩苇颜真王俊楼赵永同石继红张英起【关键词】,.freelimeticpeptide;geneexpression;EscherichiacoliAbstract:AIMTocloneandtoexpress4repeatsofEPOmimeticpeptidegene.METHODSP1)序列,选择大肠杆菌高频密码子设计合成该基因序列,EPO模拟肽合成全基因序列如下:在基因的两端加入了EcoRI,XbaI,BamHI和NheI限制性内切酶位点,以便于构建串联体和克隆.在NheI位点后和XbaI位点前加入了蛋氨酸

2、密码子,以便于表达串联体之后将其裂解为单体.DNA合成由上海生物工程公司完成.1.2方法①基因重组:质粒DNA的提取、酶切、片段回收、连接和转化均参照文献[2]进行.②SDS-PAGE:胶浓度为150gL-1,取1mL培养菌液离心收集菌体,加2×上样缓冲液煮沸,离心后上样电EcoRIXbaI5’AATTCATGTCTAGAATGGGTGGTACTTACTCTTGCCACTTCGGTCCGCTGACTTGGGTTTGCGTACGAGTCTTACCCACCATGAATGAGAACGGTGAAGCCAGGCGACTGAACCCAAACGNheIBamHIA

3、AACCGCAGGGTGGTATGGCTAGCTAG3’TTTGGCGACCCACCATACCGATCGATCCTAG泳,电泳毕以考马斯亮蓝R-250染色,脱色后观察结果.③DNA测序:均采用PE公司377型全自动序列分析仪进行.④EPO模拟肽基因4串联体的构建:将合成的EPO模拟肽全基因片段溶解于适量水中,在65℃水浴加热10min后缓慢降至室温.退火的DNA片段与经EcoRI和BamHI酶切的pBS质粒DNA连接和转化,挑取重组菌落提取DNA,以XbaI酶切初步鉴定后进行DNA测序.将获得正确序列的质粒命名为pBSEPOM1,取此质粒DNA两份,

4、一份用NheI和ScaI酶切后电泳回收小片段;另一份用XbaI和ScaI消化后电泳回收大片段.将上述回收的两个酶切片段连接后转化,提取DNA经测序确定正确重组克隆,此克隆即为EPO模拟肽基因的2串联体,命名为pBSEPOM2.再用pBSEPOM2质粒DNA按上述构建pBSEPOM2的方法操作,即可获得4串联体,命名为pBSEPOM4(Fig1).获得的pBSE-POM4经酶切鉴定和DNA测序确定其序列.⑤EPO模拟肽基因4串联体的表达:将获得的pBSEPOM4DNA用EcoRI和BamHI酶切后回收小片段(4串联体),与经相同内切酶消化处理的pBV2

5、20DNA连接后转化DH5α菌株,提取重组质粒DNA,以EcoRI和BamHI酶切鉴定,得到有插入片段的正确克隆,命名为pBVEPOM4.将含有pBVEPOM4的菌液接种于5mLLB培养基中30℃活化过夜,次日按1.5∶100的比例接种于LB培养基中,30℃培养至指数生长中期,迅速转至42℃培养4~5h,离心收集菌体,做SDS-PAGE分析.2结果2.1EPO模拟肽基因4串联体的构建鉴定①按照设计的方案进行操作,获得了EPO模拟肽4串联体(Fig2).从图中可见,经EcoRI和BamHI双酶切pBSEPOM4质粒之后,在约350bp处可见一条清晰的D

6、NA条带,其大小与理论计算值相符.②重组的pBVEPOM4质粒DNA经双脱氧末端终止法测序(Fig3).此分析结果证明,本研究构建的EPO模拟肽基因4串联体DNA序列与设计的序列完全相同.2.2pBVEPOM4的表达含重组pBVEPOM4的菌株诱导表达后,经SDS-PAGE分析,在42℃诱导后,含pBVEPOM4细菌裂解上清中出现了一条分子质量约为12ku的新蛋白带,其分子量大小与理论计算值相符(Fig4).凝胶经薄层扫描仪扫描,结果表明重组的EPO模拟肽基因4串联体的表达量占菌体总蛋白的20%左右(Fig4).图1-图4略3讨论以往构建基因串联体的

7、作者多采用随机串联的方式来获得串联体[3],此种方法的缺点是:偶然性很强,无法人为控制串联体的大小,且往往最终得不到串联体.与之相比,本研究构建基因串联体的方式有所不同,即采用特定的限制性内切酶位点来构建串联体.我们选择了XbaI和NheI两个有相同配伍末端的内切酶,分别将它们设计在EPO模拟肽基因的5’和3’末端,当用XbaI和ScaI酶切pBSEPOM1质粒时,回收的大片段中含有一个EPO模拟肽基因;当用NheI和ScaI酶切pBSEPOM1质粒时,回收的小片段中也含有一个EPO模拟肽基因,将此两片段连接在一起时,由于XabI和NheI两者的配伍

8、末端连接后,该两酶均不能再从连接位点切开DNA,这样就形成了EPO模拟肽基因的2串联体.照此构建方法类推,便

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