19 病毒对先天性心脏病先天感染的探证及电镜观察

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1、19病毒对先天性心脏病先天感染的探证及电镜观察　　摘要:目的证实部分先天性心脏病（CHD）患者心肌组织中微小病毒B19系先天感染所致，并观察CHD心肌组织超微结构变化.方法采用ELISA，PCR，原位杂交（ISH）及透射电镜等技术，对42例CHD患者及对照组22例风湿性心瓣膜病患者的外周血、活检心肌组织分别进行B19-VP2-IgM，B19-DNA的检测，并用透射电镜对心肌细胞的超微结构进行观察.结果①CHD组中B19-VP2-IgM阳性3例（7%），对照组中阳性1例（5%），两组间无显著差异（P>0.05）;②CHD组中B19-DNA阳性8例

2、（19%），与对照组均阴性相比有显著性差异（P<0.01），且与8例心肌B19-DNA阳性标本配对的血中B19-VP2-IgM均阴性;③ISH显示B19DNA定位于心肌细胞核内，电镜超微结构观察细胞胞质、核内均未见23nm病毒样颗粒，也无细胞器的损害.结论B19病毒对先天性心脏病的感染系先天性感染所致，病毒基因可能整合于宿主细胞核内.　　Keyi-croscopy，electron　　Abstract:AIMTotestiftheparvovirusB19infectionincar-diactissueincongenitalheartdis

3、ease（CHD）iscongenital，andtoobservetheultrastructuralfeaturesofcardiactissueofCHD.METHODSByusingELISA，B19-VP2-IgM　42patientsicroscopyforB19-DNAposi-tivecardiactissueofCHD.RESULTS①B19-IgMpositiveratesnorlesionofcellorganbytransmissionelec-tronmicroscope.CONCLUSIONInfectionofparvo

4、virusB19isconfirmedtobecongenitalandB19-DNAmightbeintegart-edburg公司.试验步骤为:①待检血清1∶100倍稀释（标准抗体液B及阳性对照1∶10倍稀释），取100μL加入重组B19-VP2包被的反应孔中，37℃孵育1h.②用洗涤液3～5次，每次3～5min.③过氧化物酶标记的羊抗人多克隆抗体IgM100μL，37℃孵育30min，④重复步骤②，⑤加TMB底物液100μL，室温放置10min.⑥加终止液100μL，在A450nm处15min内读取结果，结果判定:以标准抗体液（B液）吸光度20

5、.0%标准差为界值，待测孔吸光度大于其上限的为阳性.　　1.2.2巢式PCR检测B19-DNAB19病毒DNA质粒来自沙特皇家医院研究中心（KFSHResearchCenter），其他试剂系Promega公司及华美公司产品，引物设计取B19病毒特异衣壳蛋白VP1的基因保守序列，引物由上海生物工程公司合成.引物序列、病毒DNA提取及巢式PCR方法同文献［8］.　　1.2.3ISH进行B19-DNA组织定位以B19-DNA的PCR产物1112bp片段为模板，，按地高辛标记试剂盒（德国Boehringermannheim）公司产品说明，B19-DNA经低熔

6、点胶回收纯化，采用随机引物法标记探针，将准备好的组织载片，经脱蜡、脱水、消化、固定、预杂交，杂交显色，中和反应，封片观察.　　1.2.4电镜观察将新鲜组织制成1mm×1mm×1mm的组织块，置于30mL・L-1戊二醛磷酸缓冲液中，固定1h，梯度乙醇脱水和丙酮浸泡5min，E-pon812包埋，制成超薄切片，在透射电镜下观察.统计学处理:采用Epinfoversion5.0统计软件包处理.　　2结果　　2.1血清中B19┐IgM及心肌组织中B19┐DNA结果42例CHD血清中，B19-IgM阳性3例（7%），而22例对照组中B19-IgM

7、阳性1例（5%），两组比较无差异（P>0.05）.42例CHD心肌组织中，B19-DNA阳性8例，阳性率19%，对照组中B19-DNA均阴性，两组比较有显著性差异（P<0.01，Tab1）.且8例心肌标本中B19-DNA对应的血清IgM均阴性，其中B19-DNA阳性中有1例为23天的新生儿.　　2.2B19┐DNA的ISH，心肌组织形态及超微结构变化　　2.2.1CHD心肌组织的ISH结果对巢式PCR检出心肌中B19-DNA阳性8例标本进行ISH检测，结果发现有5例心肌组织中有B19-DNA的阳性信号，阳性信号主要集中于心肌细胞核内，呈紫

8、蓝色颗粒状或斑块状，较多集中在核膜下.而血管内皮与间质细胞未见阳性信号（Fig1）.　　表1两组血清、心肌中