用秀丽隐杆线虫观察43种中药的体内抗菌药效

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1、用秀丽隐杆线虫观察43种中药的体内抗菌药效作者：杨再昌，马小彦，乐意，牛玉乐，乔冲【摘要】　　目的以秀丽隐杆线虫细菌感染模型评价中药的体内抗菌作用，为发现新的抗菌先导物奠定基础。方法用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌分别感染秀丽隐杆线虫，用培养液配制不同浓度的中药提取物药液，将线虫置入药液培养，5d后观察，根据成活率、线虫体内细菌数判断药效。结果水麻叶、黄连、大接骨丹、知母、茯苓、当归、桃仁、山豆根、白虎汤对感染细菌的秀丽隐杆线虫显示出较好的保护效果，其中水麻叶作用最强；对9种提取物做体外抑菌实验，除黄连具有较弱的抗菌效果外，其它8种提取物当浓度为1600μg·ml-1时均无抗菌活性，但

2、在较低浓度时（100～800μg·ml-1）对线虫产生体内抗菌作用，与阴性对照比，降低线虫体内细菌数10～100倍。结论秀丽隐杆线虫易于培养，可感染多种细菌，具有免疫系统，繁殖成本低，适宜用于体内抗菌药物的筛选。【关键词】秀丽隐杆线虫；中药；体内抗菌由于抗生素的出现，细菌感染性疾病得到控制，但是细菌也随之对抗生素产生耐药性，这种局面促使人类必须不断开发新的抗菌药物。中草药用于治疗细菌感染类疾病已经有几千年的历史，与西医注重病原体的分离鉴定不一样，中医将细菌感染分为不同的“证”，强调“辨证论治”，强调人的体质因素。一些中药或方剂，如白虎汤，体外试验无明显的抗菌作用，但确有很好的体内抗感

3、染疗效［1，2］，说明对中草药抗菌功能的认识不能仅停留于体外抑菌试验，应该注重中药的体内抗感染作用。秀丽隐杆线虫是著名的模式生物，近年来已被用于药物筛选。Evason等［3］发现，抗癫痫药物乙琥胺（ethosuximide）能使秀丽隐杆线虫的寿命延长17%，并存在明显的量效关系。蔡外娇等［4］发现淫羊藿总黄酮能延缓秀丽隐杆线虫衰老。2006年Ausubel等［5］首次用粪肠球菌（E.faecalis）感染秀丽隐杆线虫，建立了体内抗菌药物筛选方法，发现有些化合物和植物提取物体外无抗菌活性，但具有体内抗细菌感染活性。Breger等［6］建立了白色念珠菌秀丽隐杆线虫感染模型，发现部分化合物

4、具有体内抗菌作用。可见，秀丽隐杆线虫可以用于体内抗菌中草药的筛选。本实验分别用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌感染秀丽隐杆线虫，观察了部分中草药及方剂的提取物对秀丽隐杆线虫细菌感染模型的抗菌效果。　　1材料与方法　　1.1线虫、菌株N2野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans,BristolstrainN2）和E.coliOP50由北京生命科学研究所王晓晨博士惠赠。铜绿假单孢菌（ATCC27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）由贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室惠赠。　　1.2药材黄连、金银花、白芷、山豆根、大黄、生地、玄参、白术、苍术、茯苓、麻黄、桂枝、薄荷、荆芥、防风、

5、丹参、红花、当归、桃仁、党参、山药、黄芪、厚朴、陈皮、草乌、吴茱萸、枸杞、锁阳、钩藤、白虎汤（生石膏20g、知母12g、甘草4g、粳米12g）购自贵阳市药材公司，刺三甲（根）、爬山虎（茎）、大接骨丹（根皮）、水麻叶（根）、杠板归（茎叶）、滇白珠（根）、马鞭草（全草）、鸡屎藤（茎）、千里光（全草）、葛根（根）、杜仲（树皮）、六月雪（茎叶）、商陆（根）采自贵阳市郊区。　　1.3试剂、NGM培养基、M9缓冲液头孢曲松钠（西南合成制药股份有限公司），琼脂粉、蛋白胨、牛肉浸膏（北京双旋微生物培养基制品厂），叠氮钠（Sgima公司），其余试剂均为国产分析纯。　　1.3.1NGM培养基1000ml

6、的NGM培养基含2.5g蛋白胨，3gNaCl，17g琼脂，1mol·L-1PBS液（pH=6.0）25ml，975ml蒸馏水，灭菌后加入滤膜除菌的1ml胆固醇溶液（5mg·ml-1乙醇），1mol·L-1MgSO41ml，1mol·L-1CaCl21ml。　　1.3.2M9缓冲液1000ml的M9缓冲液含15.12gNa2HPO4·12H2O，3gKH2PO4，5gNaCl，0.25gMgSO4·7H2O。　　1.4中草药提取物制备药材粉碎成过20目筛的颗粒，用70%的乙醇溶液回流提取2次，1h/次，合并提取液，用滤纸过滤后蒸干，置棕色小瓶中冰箱保存。白虎汤用蒸馏水回流提取，余同上。

7、　　1.5提取物母液的配制实验前用0.05mol·L-1的PBS液(pH=7.0)将提取物配制成1600μg·ml-1的母液，用直径为0.45μm的滤膜过滤除菌，置冰箱保存备用。　　1.6秀丽隐杆线虫细菌感染方法按照Ausubel等建立的方法进行［5］。从怀孕成虫分离虫卵，在M9缓冲液中孵化过夜，得到L1期幼虫，将幼虫转移到NGM培养基的E.coli菌苔上在25℃培养箱中继续生长48h，得到L4青年成虫，用M9缓冲液洗脱虫体并反复清洗3～4次后，将虫体分别