高通量筛选平台用于清热解毒中药的体内抗菌活性研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________高通量筛选平台用于清热解毒中药的体内抗菌活性研究姓名：段欣冉学号：2111540155院系：药学院学位类型：专业学位专业：药学研究方向：药物研发与转化导师：李健教授论文提交日期：2018年5月20日论文答辩日期：2018年5月14日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文HIGH-THROUGHPUTSCREENINGPLATFORMFOREVALUATINGTHEINVIVOANTIMICROBIALACTIVITYOFANTIPYRET

2、IC-ANTIDOTALTRADITIONALCHINESEMEDICINECandidate：XinranDuanStudentID：2111540155Affiliation：SchoolofpharmacyAcademicDegreeApliedfor：professionaldegreeofmedicineSpeciality：pharmacySupervisor：Prof.JianLiAssistantSupervisor：Prof.ZhihuiJiangDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongP

3、harmaceuticalUniversity52018广东药科大学硕士研究生学位论文高通量筛选平台用于清热解毒中药的体内抗菌活性研究摘要目的：鲍曼不动杆菌近年来呈世界性流行趋势，已成为我国院内感染最重要的病原菌之一，尤其是广泛耐药鲍曼不动杆菌（ExtensivelydrugresistantAcinetobacterbaumannii,XDRAB），耐药性的快速传播和多重的耐药机制给临床治疗带来极大的困难，开发新型抗生素迫在眉睫。中药在中国感染性疾病的治疗中有着长期的应用，积累了丰富的经验，从清热解毒中药中寻找抗菌药效物质被认为是一条有效路径。线虫感染模型具有高通量、能全面反映药物

4、体内活性等诸多优点，是抗菌药物筛选的理想实验模型。课题组前期研究初步建立了XDRAB-线虫感染模型，并将其用于抗菌活性中药的筛选，然而该模型尚不完善、筛选中药范围不够广泛。因此，本研究拟通过优化线虫感染模型的各项条件，提升模型的可靠性和稳定性；并基于该模型对多种清热解毒中药的抗菌活性进行评价，以发现具有体内抗菌活性的中药；在此基础上，进一步对活性中药主要成分的体内外抗菌活性进行评价，为研究和开发新型、高效的抗菌药物提供科学依据。方法：1.选用glp-4;sek-1双基因突变线虫，构建用于体内活性评价的XDRAB-C.elegans感染模型，通过观察线虫的存活率和生存状态，I广东药科大

5、学硕士研究生学位论文不断优化培养基组成、XDRAB的感染浓度、感染时长和药物的最佳干预时长等条件；2.2.1药材提取选取2010版《中国药典》一部中具清热解毒功效的73味中药，分别用水、50%乙醇、95%乙醇三种不同的溶剂，按1:10的物料比，通过回流提取的方法得到三种提取物，每次1小时，提取两次合并滤液后，在水浴锅上水浴干燥得到浸膏，于-20℃下保存备用。2.2活性评价将中药不同提取物稀释成五个梯度浓度（1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL），作用于感染模型，根据线虫存活率评价其体内抗菌活性。3.对筛选得到的具较好体内抗菌活性的提取物

6、，采用线虫感染模型和微量肉汤稀释法，从多方面分析比较其主要成分的体内外抗菌活性。结果：1.在构建模型时，不同浓度的XDRAB和Fe3+对线虫的致死情况不同，选择5×106CFU/mL的XDRAB并加入10μmol的Fe3+到20%BHI液体培养基中作为线虫感染的浓度。线虫生存实验显示，XDRAB感染线虫3h后线虫组与加入多粘菌素B的对照组生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=3.154，P＞0.05），感染线虫6、9h，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.001），但感染6h与9h组的生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=0.669，P＞0.05），最终选择6h作为感染时长，

7、36h为合适的抗菌药物治疗时长。II广东药科大学硕士研究生学位论文2.通过XDRAB-C.elegans模型对73味清热解毒中药提取物的体内抗菌活性进行评价，从中筛选得到具有显著体内抗菌活性的中药牡丹皮。3.对牡丹皮的四种主要活性成分丹皮酚、芍药苷、白桦脂酸、没食子酸的体内外抗菌活性进行评价，结果表明丹皮酚可以显著提升XDRAB感染线虫的生存率且无明显毒性作用；丹皮酚对XDRAB的MIC值为1024μg/mL，芍药苷的MIC值为2048μg/mL，没食子酸